1芹菜中芹菜素的优化提取、含量分布关系及其杀菌作用的初步探芹菜中芹菜素的优化提取、含量分布关系及其杀菌作用的初步探究究南方医科大学 公共卫生与热带医学学院 2010 级 预防医学 张 欢 13266328947南方医科大学 公共卫生与热带医学学院 2010 级 预防医学 巫文威 13266342249南方医科大学 第一临床医学院 2010 级 临床医学五年 钟海燕 132492194752目目 录录1 前言-42 实验目的-43 实验原理-44 实验设备-55 实验材料及试剂-56 实验步骤-57 实验结果及计算-108 实验预期及可行性评估-159 注意事项-1510 实验预算-1611 参考文献 -163摘摘 要要芹菜素是一种常见的黄酮类化合物，在芹菜中含量相对较多，具有抗炎作用。本实验欲通过正交试验法探究提取芹菜素的最适条件，并从芹菜的根、茎、叶中提取芹菜素来比较三者间芹菜素的含量，及通过与乙酰水杨酸比较来判断芹菜素的抗炎效果。关键词：关键词： 芹菜素 正交试验 抗炎作用 乙酰水杨酸41 1 前言前言如今由于抗生素的滥用，细菌耐药性越来越强，研究新的不易使细菌产生耐药性的抗炎药迫在眉睫，而芹菜素很好地符合了人们的预期。研究表明，芹菜素具有抗炎作用，与其他黄酮类物质相比，具有低毒低毒、无诱变性无诱变性的特点，有望成为理想的新型抗炎药。另外芹菜素作为一种天然存在的黄酮类化合物，广泛地存在于食物中，以芹菜居多，且芹菜中根茎叶所含芹菜素量不同，研究芹菜不同部位芹菜素的含量关系为我们日常生活对芹菜取食部位和工厂优化选取原材料以获取芹菜素的方案提供参考。因而本次试验对于探究新型抗炎药和综合利用农产资源具有实际意义和良好的经济效益。2 2 实验目的实验目的2.12.1 用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。2.22.2 从芹菜不同部位根、茎、叶中提取芹菜素，用紫外分光光度法分别测定芹菜根、茎、叶中芹菜素的含量并比较芹菜素在不同部位的含量关系2.32.3 究芹菜素抗炎效果的最佳剂量，以及和乙酰水杨酸抗炎效果的比较，探究芹菜素在新型抗炎药方面的应用。3 3 实验原理实验原理3.13.1 用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。用正交试验对提取溶剂乙醇含量、料液比、提取温度及提取时间进行研究,在此基础上确定上述4 个因素的最佳组合。3.23.2 芹菜不同部位根、茎、叶中提取芹菜素，用紫外分光光度法分别测定芹菜根、茎、芹菜不同部位根、茎、叶中提取芹菜素，用紫外分光光度法分别测定芹菜根、茎、叶中芹菜素的含量并比较芹菜素在不同部位的含量关系叶中芹菜素的含量并比较芹菜素在不同部位的含量关系芹菜素，又称芹黄素，化学名称为 4 ，5,7-三羟基黄酮，属于黄酮类（其结构式见图图 1 1） ，几乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇。从植物中提取芹菜素时因其多以芹菜素的C-糖苷化合物存在而微溶于水，因此用乙醇溶解并采用索氏提取法提取。查资料知芹菜素标准对照品的最大吸收波长为 345nm。在用乙醇提取芹菜素前，分别用乙酸乙酯对芹菜进行预处理至提取液为无色，目的为将叶绿素等脂溶性成分除去。黄酮类化合物与 1%氯化铝生成黄色络合物，并有荧光。5图图 1 1：芹菜素的结构式3.33.3 究芹菜素抗炎效果最佳剂量以及和阿司匹林的有效成分乙酰水杨酸杀菌作用的比较究芹菜素抗炎效果最佳剂量以及和阿司匹林的有效成分乙酰水杨酸杀菌作用的比较从芹菜中提取的芹菜素具有抗炎作用，通过设置不同浓度的芹菜素对大肠杆菌（革兰氏阴性）和金黄葡萄球菌（革兰氏阳性）的杀菌效果来探究芹菜素抗炎效果的最佳浓度。另外，以芹菜素最佳杀菌浓度与同浓度的乙酰水杨酸比较二者杀菌效果。大肠杆菌和金黄葡萄球菌用次甲基蓝染色液染色后，活菌显无色，死菌呈蓝色或者淡蓝色。4 4 实验设备实验设备圆底烧瓶（100ml,250ml 各 1 个） 、温度计（1501 支） 、量筒（100ml 2 个） 、烧杯（50ml 6 个 250ml 2 个 500ml 1 个） 、索氏提取器（1 套） 、冷凝管带胶管（1 套） 、滤纸、中等试管（6 支） 、中等试管带棉塞（15 个） 、试管架（2 个） 、电热套（1 个） 、电炉（1 个） 、电热恒温鼓风干燥箱（1 个） 、台式高速离心机（1 台） 、UV-1100 型分光光度计（1 台） 、电子天平（1 台） 、容量瓶（50ml 100ml 各 2 个） 、刻度吸管（10ml 2ml各 1 支） 、 培养皿（9 个） 、吸量管（1ml 2 支） 、高压灭菌锅（1 个） 、酒精灯（1 盏） 、恒温箱（1 个） 、相差显微镜（1 台） 、试管刷（3 个） 、蒸发皿（1 个） 、三角架（1 个） 、锥形瓶（2 个） 、牛角管（1 个） 、石棉网（1 个） 、铁架台（2 个） 5 5 实验材料及试剂实验材料及试剂材料：纯品芹菜素 50mg、市售新鲜中国本土的小芹菜 1kg（连同根、茎、叶） 、大肠杆菌、金黄葡萄球菌试剂： HCl 溶液（1.0mol/L，0.1mol/L） 、NaOH 溶液（1.0mol/L，0.1mol/L） 、乙醇溶液（70、50%） 、乙酸乙酯 350ml、乙酸 2ml、乙酰水杨酸 10mg、蛋白胨 110g、牛肉膏 33g、氯化钠 45g、生理盐水、1%氯化铝溶液 5ml、次甲基蓝染色液 10ml6 6 实验步骤实验步骤66.16.1 准芹菜素紫外标准曲线的制作准芹菜素紫外标准曲线的制作6.1.16.1.1 取芹菜素标准品 5.55mg，用 70微热乙醇溶解，并定容于 100ml 容量瓶中，瓶中加两滴乙酸溶液，配成 55.5g/ml 的溶液备用。量取表表 1 1 所列芹菜素标准品溶液的毫升数，分别加入 50ml 容量瓶中用 70乙醇定容，配成不同浓度的芹菜素标准溶液。6.1.26.1.2 分光光度计测芹菜素标准对照品溶液 345nm 处吸光值(结果填入 7.1.1 表表 2 2 中)以浓度（g/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线（见 7.1.17.1.1 中图图 2 2） ，并计算回归方程式。表表 1 1：芹菜中芹菜素的 UV-标准曲线试验号123456芹菜素标样（ml）03691215浓度（g/ml）03.336.669.9913.3216.656.26.2 使用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。使用正交试验法对芹菜中芹菜素的提取工艺进行优化研究。6.2.16.2.1 确定指标确定指标即实验的结果。本实验的指标是芹菜素提取浓度。6.2.26.2.2 制定因素水平表制定因素水平表考察四个因素（乙醇含量、料液比、 提取时间、 提取温度） ，每个因素取三个水平（如表表 3 3） 。表表 3 3 因素水平表水平A乙醇含量（ % ）B料液比（ g : ml）C提取时间（ min ）D提取温度（ ）1601 7.515402701 1030503801 12.5456076.2.36.2.3 选择正交表选择正交表可容纳四因素三水平的正交表有 L9、L27 和 L18。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为 3 的的四个因素，故选用 L9表(L 是正交表的代号，L 右下角的数字表示试验次数)，见表表 4 4。表表 4 4 正交实验表(L9表)试验号12341111121222313334212352231623127313283213933216.2.46.2.4 具体操作步骤具体操作步骤将本实验的四个因素依次放在 L9的第 1，2，3，4 列，再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，就得到下面的试验安排（见下表）8表表 5 5实验号123456789乙醇含量（%）606060707070808080料液比（ g : ml）1：7.51：101：12.51：7.51：101：12.51：7.51：101：12.5提取时间（min）153045304515451530提取温度（ ）40预温5min , 40提取50预温5min ,50提取60预温5min, 60提取60预温5min, 60提取40预温 5min , 40提取50预温5min ,50提取50预温5min ,50提取60预温5min, 60提取40预温5min , 40提取表中试验号共 9 个，表示要做 9 次试验，每次试验的条件如每一纵行所示。6.2.4.16.2.4.1 采摘芹菜叶，烘干磨碎，先后用乙酸乙酯对其进行预处理至提取液为无色，干燥后用电子天平分别称取 15g，装入索氏提取器的滤纸筒中，将相应料液比、相应浓度的乙醇注入到提取器中，在相应温度下连续抽提相应时间。抽提结束后可对乙醇进行回收同时对抽提液初步浓缩。定性鉴定:取少量所得浓缩液于试管中，加入适量 1%氯化铝溶液，进行芹菜素的鉴定。若溶液产生黄色络合物，则表明提取物为芹菜素粗品。6.2.4.26.2.4.2 将提取液分别在 3000r/min 的离心机中离心，再浓缩上清液，测量浓缩后液体体积（VmL） ，用 50乙