热休克蛋白9 0 在糖皮质激素反应性中的作用研究欧阳涓姜傥众多免疫损伤性疾病的发生、发展都与机体免疫调节功能紊乱有着密切的关系。根据神经内分泌免疫调节学理论，机体免疫活动及其功能状态直接受神经、内分泌系统的调控。当机体遭受抗原刺激后，一方面会激发机体免疫系统进行防御；另一方面则可以通过神经、内分泌系统释放大量激素、细胞因子去调控免疫系统的过度活动，以免造成相应的组织损伤。换言之，机体的免疫性损伤与神经、内分泌免疫调控异常之间不无关系。在人体的神经内分泌免疫调节网络中，下丘脑一垂体一肾上腺轴的调节对于维持机体自稳状态十分关键，其中糖皮质激素( G C ) 作为下丘脑一垂体一肾上腺轴的关键分子，不仅在体内参与调节机体免疫功能，抑制免疫系统的过度活跃，而且在体外一直被作为治疗性药物，对I N S 、哮喘等免疫损伤性疾病发挥重要的治疗作用。但是临床上用糖皮质激素治疗的患者对激素治疗的反应性不尽相同，即呈现G C 敏感、依赖甚至抵抗的临床征象。对于G C 抵抗型患者，即使加大临床G C 用量，也并不能改善其症状和预后，反而易导致因大剂量G C 使用而引起种种副作用的产生。我们既往研究尚发现C a 2 抵抗也可能影响其对自身免疫系统的调节，从而成为免疫性损伤的重要发病机制。因此，极有必要对G C 抵抗的机制进行深入探讨。 ( E 发挥效应要通过其受体。即糖皮质激素受体( G R ) 。 热休克蛋白9 0 ( H S P 9 0 ) 作为G R 的伴侣蛋白，它主要分布在细胞浆中。本文对H S P 9 0 在G C 信号传导中的作用，以及在 不同G C 反应性患者中H S P 9 0 的表达、分布及与G R 受体的关系进行研究，籍以评价其在C a 2 反应性中所起的重要作用。 l 材料与方法1 1 外周血单个核细胞( P B M C ) ： 体外培养的P B M C 提取自肝素抗凝静脉血，标本来源健康志愿者，在静脉采血前1 周内，未患感染性疾病，未曾服用 过G C 和免疫抑制剂。体内研究的P B M C 来自I N S 组：中山大学附属第一医院肾内科住院的I N S 患者5 1 例。患者平均年龄3 2 1 1 9 岁( 1 8 - - 6 5 岁) 。其中男3 3 例，女1 8 例。5 1 例患者接受了常规标准激素疗程。根据患者对C a 2 反应性，将患者分为两组：一组为G C 敏感组：G C ( 泼尼松) 足量治疗8 周时和G C 减量后，尿蛋白持续为阴性者，共2 5 例；一组为G C 抵抗组：泼尼松足量治疗8 周，尿蛋白仍维持在( + + ) 以上，共2 6 例患者。两组病例的发病年龄、病程、G C 用量、血尿素氮、肌酐和白蛋白水平差异无显著意义，标本收集均在清晨进行。健康对照组：选择了2 3 例健康献血员作为对照，年龄3 1 1 0 6 岁( 1 6- - 6 0 岁) 。在静脉采血前1 周内，未息感染性疾病，未曾服用过G C 和免疫抑制剂。肝素抗凝静脉血F i c o U 法提取P B M C 。作者单位：5 1 0 0 8 0 广州，中山大学附属第一医院检验医学部肾内科6 5 一部分P B M C 加入l m lT r i z o l 试剂后置一7 0 保存，用于提取 碰蚣；一部分P B M C 做细胞涂片用于激光共聚焦免疫荧光检 测H S P 9 0 表达及分布。1 2 化学试剂无酚红R P M I 一1 6 4 0 培养基购自H Y C L O N E 公司；胎牛血 清购自杭州四季青公司；地塞米松D E X 购自S I G M A 公司( 批号1 1 2 K 8 9 3 1 ) ；格尔得霉素G A 购自A L E X I S 公司( 批号L 0 9 4 5 2 ) ；碘化丙啶P I 、吖啶橙A O 购自S I G M A 公司；溴化乙锭E B 购自广州威佳公司。小鼠抗人H S P 9 0 单克隆一抗 ( 批号：1 3 3 1 0 4 0 6 ) 和F I T C 标记羊抗小鼠二抗( 批号：1 0 8 4 0 8 ) 购自S t r e s s g e n 公司。总R N A 提取试剂删( 批号：1 1 7 3 3 6 ) 购自I n v i t r o g e n 公司。逆转录试剂盒( 批号：0 9 2 0 ) 和P C R 试 剂( 批号：4 6 5 2 ) 购自M B I 公司。淋巴细胞分离液购自上海生化试剂二厂。1 3 引物H S P 9 0 引物序列来自文献，H S P 9 0 上游引物：5 G T CT G G G T A T ( Y 3 ( j A A A G C A A G 3 ；H S P 9 0 下游引物：5 C T G A G GG T TG G GG A TG A TG r c 3 ，扩增片段长度3 0 3 b p 。 G R 引物自行设计，序列为：上游引物：5 1 r AC C AC A A a A C CC ( 卫A C C3 ；下游引物：5 G G CT C TT C AG A C C G TC C TT A3 ，扩增片段长度4 7 5 b p 。为进行半定量分析的需要，以( 一a c t i n 为内参照，( - f l c t i n 上游引物：5 G G A T T C C T A T G TG G GC G A 3 ；下游引物：5 G G AA C CG C TC A T“ I v G CC A AT G 3 ，扩增片段长度6 1 7 b p 。上述引物均由上海生 物工程技术公司合成。 1 4 细胞培养上午8 时采集肝素抗凝肘静脉血1 0 m l ，用F i e o l l 法提取 P B M C 。将提取的P B M C 细胞悬于含1 0 胎牛血清、青霉素( 1 0 0 U “) 和链霉素( 1 0 0 u g m 1 ) 的无酚红R P M I 1 6 4 0 完全培养基中，调整细胞数1 0 6 m l ，并用台盼蓝染色判断细胞活力， 然后加入2 4 孔板。每孔加入P B M Cl r n l ，共分4 组，每组设4个复孔。分别按组加入H S P 9 0 特异性阻断剂格尔得霉素 ( G Al t , M ) 、x ( 1 脚) 、G A + D E X ，另设自发培养孔作为空 白对照。由于G A 是用D M 9 0 作为溶媒，因此在自发培养孔 和D E X 孔加入相同浓度的D M S O ( O 5 9 6 ) 作为平行对照。3 7 二氧化碳培养箱( 5 C 0 2 9 5 空气) 中培养4 8 小时后进行P 瑚C 凋亡的定量和定性检测。 1 5 亚G 1 峰法定量检测P B M C 的凋亡用巴氏滴管吹打均匀孔板中培养4 8 小时后的P B M C 细胞，收集至1 5 m l 的E P 管中，离心去掉培养基，加入l 一2 滴0 1 M P B S 混匀成细胞悬液，加入l m l 预冷的( 4 ) 7 0 的乙醇倒转混匀，4 “ C 固定2 小时以上。再次离心，( 1 0 0 0 r p m ，5 分钟) 弃去酒精。再重复洗涤一次。然后将细胞重新悬于3 0 0 u t D N A 染液( 含P I1 0 0 t , g m l 和R N A 酶2 0 单位m 1 ) ，室温放置 3 0 分钟进行D N A 染色后上流式细胞仪( 嘲 2 0 。2 2 2R T P C R 产物的鉴定分析R T - P C R 产物电泳后发现扩增产物均为单一、特异性产 物；产物长度与理论设计要求片段长度相符。由于在引物设计时注意了上下游引物跨越内含子，从而防止了R N A 样品中如果有D N A 污染可能带来的干扰。2 2 3H S P 9 0 与G Rm R N A 的表达分析 P B M C 中G Rm R N A 的表达在G C 抵抗组、G C 敏感组I N S 患者及健康对照组间未发现有明显差异( P 0 0 5 ) 。与 此同时，检测P B M C 中H S P 9 0m R N A 表达水平发现，所有I N S 患者( 包括G C 抵抗组和G C 敏感组) 的表达均高于健康对照组，且G C 抵抗组鸸0m R N A 水平显著高于G C 敏感 组( P 值 0 0 5 ) 。H S P 9 0 G R 比值分析显示：I N S 组较健康对照组明显升高( P 值 0 0 5 ) 。2 3I N S 患者不同组别P B M C 中H s P g o 蛋白的表达与分布 采用激光共聚焦技术观察P B M C ，显示G C 敏感组I N S 患者P B M C 中的H S P 9 0 表达增强，分布仍以细胞浆为主；而 G C 抵抗组I N S 患者增加的H S P 9 0 则明显趋向细胞核内分 布。3 讨论作为糖皮质激素受体G R 的伴侣蛋白，目前已经发现H s P 9 0 的功能包括：与G R 结合后可使其形成“袋状”结构，并 获得与G C 配体的结合能力；可促进活化的G R 向核内转运； 在核内与G R 解离后，后者方舶与D N A 结合，介导G C 发挥相应的作用。鉴于H S P 9 0 与G R 之间的密切关系，我们体外 培养P B M C ，并检测了H S P 9 0 在G C 诱导P B M C 凋亡中的作用。P B M C 主要成分为淋巴细胞( T 细胞占约8 0 、B 细胞和 N K 细胞) 及少量单核细胞，它们是神经内分泌免疫网络调节中的重要靶细胞，是机体免疫应答的主要承担者，有文献报道在体外细胞水平，P B M C 对皮质类固醇的反应性与机体临床上对类固醇激素治疗的反应性相关。G A 是一种苯醌类大环内酯类抗生素，具有特异性结合 和拮抗H S P 9 0 的作用。我们的实验结果显示加入G A 后， D E X 诱导P B M C 凋亡显著减少，这说明H S P 9 0 在C , - C 信号传 导通路中有着重要作用。我们又深入研究了H S P 9 0 在不同 G C 反应患者P B M C 中的表达、分布及其与G C 效应发挥、治疗作用之间的关系乃至调节机制。I N S 是一种临床常见的免 疫损伤性疾病。目前，对I N S 患者的治疗主要以G C 为首选， I N S 患者的预后及疾病转归很大程度上取决于患者对G C 治疗的反应性，患者对C , C 的不同治疗反应直接影响了疾病的疗效及转归，临床上难治性肾综已成为治疗中最为棘手的问 题。实验结果提示，I N S 患者组与健康对照组在G R 表达水平上并未发现有显著差异，这一发现与H a a c kD 等人的研究 结果相似。然而，在I N S 患者H S P 9 0 m R N A 的表达明显高于 健康对照组，且G C 抵抗组J N S 患者H S P 9 0m R N A 水平高于 ( 咒敏感组1 N S 患者( P 值均 0 0 5 ) 。这一现象可能与 H S P 9 0 在炎症等病理状态下应激性增加有关，而H S P 9 0 的表达异常增加可能在一定程度上影响了G R 功能的正常发挥。两种方法测定甲胎蛋白的偏倚评估高玲孙艳虹曾智杰李仲廷甲种胎儿蛋白( a l p h a f e t o p r o t e i n ，A F P ) 是胎血中的重要血清成分，由卵黄囊和肝脏细胞合成，分子量约为6 8 0 0 D ，是一条多肽链糖蛋白，由5 9 0 个氨基酸组成，含糖量4 ，与白蛋白有5 0 的氨基酸相同，等电点4 7 4 8 ，电泳时位于白蛋白与廿球蛋白之间。它的升高或降低对原发性肝癌，睾丸和卵巢癌的早期诊断和预后及反映胎儿状态有一定意义，因 此，准确测定血清A F P 的含量对临床诊断、疗效观察及预后判断具有十分重要的意义。目前测定A F P 的方法有酶联免疫吸附试验法( E L I S A ) 、 放射免疫分析法( R 认) 和微粒子酶免疫分析法( 溉n ) 。E