高压液相色谱高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法常见故障及排除方法诊状 (一)保留时间变化 可能的原因 : 解 决 方 法 1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用25mmol/L 的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱 (二)保留时间缩短 可能的原因 : 解 决 方 法 1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量 3.键合相流失 : 流动相 PH 值保持在 37.5 检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温 (三)保留时间延长 可能的原因 : 解 决 方 法 1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉 可能的原因 : 解 决 方 法 1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子 (五)鬼峰 可能的原因 : 解 决 方 法 1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC 级的水 (六)基线噪声 可能的原因 : 解 决 方 法 1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用 HPLC 级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压 (七)峰拖尾 可能的原因 : 解 决 方 法 1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相 PH 值,钝化样品 4.同前(四)4 : 同前(四)4 5.同前(四)3 5. : 同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽 可能的原因 : 解 决 方 法 1.进样体积过大 : 同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于 10 点 4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10% 5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载 : 进小浓度小体积样品 液相色谱柱使用及保养液相色谱仪液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色 谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的 必经之路。 一、液相色谱柱的安装：1、液相色谱柱的结构：a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为 7/16 英寸外螺纹，另一端是 316 英寸的内螺纹(国内外已规范化)。716 英寸外螺纹与 14 英寸柱管(6.35mm)连接，中间放置压 坏用于密封。316 英寸的内螺纹与 116 英寸(1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱 接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用 1.57mm 连接管通过空心螺钉压环 后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过 压环后露出的管长度应严格控制在 25mm 长或其他固定尺寸)。在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外 而流失。空柱各组件均为 316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其 有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。b、柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在 310 m 的范围 内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2 等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和 球型之分。常用的其他的反相填料还有键合 C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在 310 m 之间。2，色谱柱的安装：a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为 1.57mm、内径为 0.1-0.3mm 的 不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接 管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手 继续顺时针拧 14-12 圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳 手继续顺时针拧 14 圈，直至不漏液为止。 二、液相色谱柱的使用：色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。 但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱 性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样， 测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用 0.45m 的过滤膜过滤除去微粒杂质。2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以 下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降， 延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的 溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以 防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱 柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6mm 的色谱柱，流速一般选择 1mlmin， 对于内径为 4.0mm 柱，流速 0.8mlmin 为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如 使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：a由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。b对于正相柱推荐使用沸程为 30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得 使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于 18 兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响 分析结果。c含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮 化钠，防止细菌生长。d流动相要求使用 0.45 m 滤膜过滤，除去微粒杂质。e使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。4、柱性能测试：启动液相色谱仪液相色谱仪：a、流动相流速设定为 1mlmin。b、UV 检测器波长设定为 254nm。使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。记录并计算测试结果。*参考(标准 JB5226-91)液相色谱仪液相色谱仪测试用标准色谱柱。 高压液相色谱 HPLC 培训教程(一) I概论 一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中 滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的， 色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、 液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相 色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时） 。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速 发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻 力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相 色谱。 二、HPLC 的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压-压力可达 150300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。 高速-流速为 0.110.0 ml/min。 高效-可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在 1530 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化 合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。 液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样可分为液固色谱法(LSC) 和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的 一种物相）为流动相（常用 CO2） ，因其扩散系数大，能很快