247实验十一实验十一 亲和层析纯化胰蛋白酶亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言一、引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。另外 ，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。 二、实验目的与要求二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。 三、基本原理三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离） 。如：酶 和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。特异性的抗体一抗 原（包括病毒、细胞） 、激素与其受体、载体蛋白，基因与其互补 DNA、mRNA 及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术” 。在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ） ，在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如 Sepharose 4B）制成亲和吸附248剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程可用简图表示如下：亲和层析原理示意图本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH = 78 的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在 pH =23 时，又能被解离下来。因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于 10,000 BAEE 单位/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到 10 20 倍以上。 四、试剂与器材四、试剂与器材主要试剂：主要试剂：丙酮 三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙烷 乙腈 甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏 鸡蛋清 乙酸 二氧六环 二甲基亚砜主要贮存溶液：主要贮存溶液：1. 鸡卵粘蛋白层析液（1 升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3 升。3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含 0.3mol/L NaCl, 150ml.4. 标准胰蛋白酶溶液：结晶胰蛋白酶以 0.001N HCl 配制成 50g/ml。5. 亲和层析柱平衡液：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含 0.5mol/LKCl Comment Duan1: Page: 249249、0.05mol/L CaCl2, 500ml。 （配 1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2） 。6. 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含 0.2% Cacl2（全斑公用，配1000ml：6.05g Tris 水溶后，先用 4mol/L HCl 调 pH 为 8.0，然后方可加 2g Cacl2 ） 。 7. 亲和柱解吸液：0.1mol/L 甲酸0.5 mol/L KCl pH = 2.5 , 500ml。 （配1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸） 。8. Sepharose 4B 胶清洗液：0.5mol/L NaCl 和 0.1mol/L NaHCO3 缓冲液，pH = 9.5, 各 500ml.9. BAEE 底物缓冲液：34mg BAEE 溶于 50ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris -HCl buffer中，临用前配制，冰箱内可保存 3 天。主要器材：主要器材：恒温水浴，温度计，G2 玻璃漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml） ，透析袋，层析柱（230cm,2630cm） ，秒表，移液管，贮液瓶（1 升） ，电磁搅拌器，pH 计，紫外分光光度计，纱布，匀浆器，pH 试纸。 五、实验操作步骤五、实验操作步骤（一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化（一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化1. 鸡卵粘蛋白（鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质）的一些性质:Ovomucoid 是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂，均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下，易引起变性。 Ovomucoid 带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在 50%丙酮或 5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的 pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。由于 Ovomucoid 所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，等电点在 3.9 4.5之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无差异，分子量约为 28,000。每 1 摩尔的卵粘蛋白分子能抑制 1 摩尔的胰蛋白酶。所以每毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约 0.84 毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm 处的百分消光系数 A1%1cm.280 = 4.13. ， 即蛋白酶浓度为 1mg/ml 时,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。2. Ovomucoid 的分离及粗品制备：的分离及粗品制备：取 2 只鸡蛋，得蛋清约 50 ml ，将其温热至 25左右，加入等体积 10 % pH = 1.0的三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：称取 10 克三氯乙酸，用 70 ml 蒸馏水溶解，再用5mol/L NaOH 调 pH = 1.0 左右，最后加蒸馏水至 100ml。 ） ，这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，测定溶液的 pH 值，此时溶液的 pH 值应当是 3.50.2 ,若偏离此值，用 5N HCl 或 5mol/L NaOH 溶液调 pH = 3.50.2 ，注意在调 pH 值时，要严防局部过酸或过碱。接着 25放置 4 小时或过夜。次日用 40006000 转/分 离心 20 分钟，收集清液，再用三层纱布过滤并检查滤液的 pH 值是否仍为 3.50.2，若不是，则要调回到此范围内。然后将清液放冰浴冷却至 0，缓缓加入 3 倍体积预先冷却的丙酮，用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好防止丙酮挥发，放冰箱或冰浴中 3 4 小时后，离心（ 3000 转/ 分，15 20 分钟）收集沉淀（清液留待回收丙酮） 。将沉淀抽真空去净丙酮，得到粗的250卵粘蛋白。将其用 20 ml 左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透析袋，并对蒸馏水透析去除三氯乙酸（或用 Sephadex G - 25 凝胶层析柱脱盐去除三氯乙酸） 。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于 7000 BAEE / mg ，可直接用作亲和配基制备亲和吸附剂，否则应进一步纯化。 3. Ovomucoid 的纯化的纯化DEAE-纤维素的处理：称取 10 克 DEAE - Cellulose 粉（DE - 32） ，先用约 150 ml 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH 溶液溶胀 30 分钟，用 G2 漏斗抽干并用去离子水冲洗至中性，转入烧杯中再用约 150ml 0.5mol/L HCl 浸泡 20 分钟，再在 G2 漏斗中用蒸馏水洗至中性，最后用约 150 ml 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 缓冲液浸泡，抽真空去气泡后装柱（2cm20cm 柱） ，并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用。将粗的 Ovomucoid 制品加入等体积的 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 绥冲液后上柱吸附，并用同一缓冲液洗杂蛋白至 A2800.400，则酶液应当稀释或减量，控制A253/min 在 0.05 0.100 左右为宜。绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0，25，反应体积3.0ml，光径 1 厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253增加 0.001，反应液中所加入的酶量为一 BAEE 单位。所以：胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE 单位 / ml） 稀释倍数酶液加入体积 001. 0(min)253A胰蛋白酶比活力（BAEE 单位 / mg ） 酶液加入体积胰酶浓度酶液活力 )(mlmg2. 卵粘蛋白抑制活性的测定卵粘蛋白抑制活性的测定胰蛋白酶抑制活力单位的定义：抑制一个胰蛋白酶活力单位（BAEE 单位）所需卵粘蛋白的量，定为抑制剂的一个活力单位（英文缩写为 BAEE TIu） 。具体测定方法如下：首先以底物（不加酶）于 253nm 处校正仪器光吸收零点 （操作如上述） ；再测定标准酶的活力单位（操作如上述） ；测定加入抑制剂后剩余酶活力单位；在比色杯中加入 0.2ml 上述标准酶液再加入适量的抑制剂（一般不能超过标准酶含量，以 1：2 左右为宜，具体视抑制剂的纯度而定） ，再加入 1.8 ml 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl 缓冲液，摇匀后于 25放置 2 分钟以上，让酶与抑制剂充分结合。最后加入0.8ml 底物（BAEE 溶液） ，摇匀立即记时，测定 A253的变化。计算剩余酶活力单位。按下面方式计算出抑制剂的抑制活力和抑制比活力：抑制剂溶液的抑制活力 Iu （BAEE 抑制单位