2 3 ( 增刊) ，2 0 0 35 9用细胞膜色谱法筛选红毛七中血管生成抑制作用的部位李义平贺浪冲( 西安交通大学天然药物研究与工程中心陕西西安7 2 1 0 0 6 )细胞膜色谱( C e l lM e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y ，C M C ) 筛选技术可以模拟药物与受体间的相互作用，把细胞膜色谱筛选与传统天然药物化学的分离相结合，可以快速分离得到活性部位和活性成分，通过药效试验确定为有效部位和有效成分。该文报道用人血管内皮细胞膜色谱模型筛选秦巴山区特有植物红毛七中抑制血管生成作用的有效部位。1 仪器与试药1 1 仪器W a t e r s 高效液相色谱系统，包括4 8 6 型紫外检测器、5 1 0 型色谱泵、7 1 2 5 型手动进样阀( 美国R h e o d y n e 公司) ；A N A S T A R 色谱工作站( 奥泰科技有限公司) ；H E R M L EZ K 一4 0 1 型低温冷冻高速离心机( 德国) ；L K B 一2 2 1 9 型循环水浴( 瑞士) ；R E - 5 2 型旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ；S H Z 一9 5 型循环水式真空泵( 河南巩义市英峪予华仪器厂) ；D G 5 0 3 1 型酶联免疫检测仪( 南京华东电子集团股份有限公司) 。1 2 试药R P M I 一1 6 4 0 培养基( L i f eT e c h n o l o g i c s 公司) ；小牛血清( 杭州四季青公司) ；二甲基亚砜( D M S O ) 、噻唑盐( M T T ) ( S i g m aC h e m i c a l 公司) ；大黄素对照品( 中国药品生物制品鉴定所) ；硅胶( 中国青岛海洋化工集团) ；三重蒸馏水( 实验室自制)红毛七为小檗科牡丹草属植物类叶牡丹L e o n r i c er o b u s t u m ( M a x i m ) D i e l s 的根茎及根，采自秦巴山区太白县太白山。经西安交通大学药学院生药教研室吕居娴教授鉴定。人脐静脉血管内皮细胞株( E C V 3 0 4 ) ( 购自中国科学院上海细胞生物研究所) 。2 方法与结果2 1 筛选条件自制血管内皮细胞膜色谱柱( 5 0 r a m 2 m m ) ；流动相：三蒸水；柱温：3 7 。C ；检测波长：2 5 4 n m ；流速：0 2 m L m i n ；用流动相平衡后，进样分析。2 2 红毛七活性部位的筛选2 2 1 供试品溶液的制备将红毛七植物晒干碾碎，取适量用9 5 乙醇回流提取3 次，每次2 h ，合并滤液，回收乙醇。取适量红毛七总提取物用甲醇溶解，为红毛七总提取物供试品溶液( H M Q Z ) 。取红毛七总提取物，加适量水溶解后，以5 稀盐酸调p H 值为2 3 ，酸水液用氯仿萃取，回收溶剂，用适量甲醇溶解，为酸性部分供试品溶液( H M Q A ) 。经萃取水液，稀N a O H 液调p H 值为9 1 0 ，用氯仿萃取，回收溶剂，用适量甲醇溶解，为红毛七总碱供试品溶液( H M Q B ) 。2 2 2 血管内皮细胞膜色谱筛选分别吸取供试品液( H M Q Z ，H M Q A ，H M Q B ) 5uL ，注入血管C M C 系统分析。以大黄素为对照，结果显示H M Q Z 、H M Q B 的色谱图上有明显的保留色谱峰，而H M Q A 的色谱图上无保留峰( 图1 ) 。提示红毛七H M Q B 中有与E C V 3 0 4 细胞膜及膜受体发生亲和作用的物质，而H M Q A 中没有这些物质。2 2 3H M Q B 的分离与筛选经薄层层析确定分离条件，以硅胶为填料，不同比例的氯仿和甲醇为洗脱剂进行柱层析，分为四个部位( H M Q B 一1 ，H M Q B 一2 ，H M Q B 一3 ，H M Q B 一4 ) 。以上四个部位用甲醇溶解，分别吸取供试品液( H M Q B - 1 ，H M Q B 一2 ，H M Q B 一3 ，H M Q B 一4 ) 5uL ，注入血管C M C 系统分析。以大黄素为对照，结果显示H M Q B 一2 的色谱图上有明显的保留色谱峰，而其余的色谱图上无保留峰( 图2 ) 。提示H M Q B 一2 为红毛七中在血管内皮细胞膜色谱模型上有保留的活性部位。6 0药物分析杂志r 1 F 否1 广丁1 f 1 苫r M i n u t e 5M i n u t t 5图1 大黄素( A ) 、H M O B ( B ) 在血管内皮C M C 柱上的保留色谱图 卜大黄素；2 一删Q BF i g1C h r o m a t o g r a m so fe m o d i n ( A ) a n dH M Q B ( B ) o nt h eE C V 3 0 4C M Cc o l u m n1 - e m o d i n ：2 一删Q BM i n u t e 5图2H M Q B - 2 在血管内皮C M C 柱上的保留色谱图F i g2C h r o m a t o g r a m so f 咖Q B 一2o nt h eE C V 3 0 4C M Cc o l u m n2 3 药效试验以不同浓度H M Q B - 2 作用于培养的E C V 3 0 4 细胞上，以大黄素为阳性对照，溶媒( 0 I D M S O )为阴性对照。细胞增殖实验采用M T T 法( 四氮唑盐比色法) 。结果显示随着H M Q B 一2 浓度的增加，吸光度减小，抑制率增加，有明显的量效关系。从剂量反应曲线中( 图3 ) ，可得半数抑制浓度为1 4 0 9 9 m L 一，提示删Q B 一2 具有显著的抑制E C V 3 0 4 细胞增殖的作用。水褂7 0 粪6 05 04 03 02 01 00O2 04 06 08 0H I F I Q B 2 浓度( ug m L l )图3H M Q B 一2 对E C V 3 0 4 的抑制作用F i g3I n h i b i t i o no fH M Q B 一2o nt h ep r o l i f e r a t i o no fE C V 3 0 43 讨论血管的形成与肿瘤的生长，侵袭和转移有着十分密切的关系。血管新生需要血管内皮细胞的增殖，因此能抑制血管内皮细胞的增殖，既可起到抑制肿瘤血管生成的作用。2 3 ( 增刊) ，2 0 0 36 1人血管内皮细胞株E C V 3 0 4 来源于人脐静脉血管内皮细胞，分离细胞膜并制备细胞膜色谱柱，对大量的中草药进行筛选，寻找对血管内皮细胞膜及膜受体有作用的活性成分，并用M T T 实验进一步验证其药效。此方法与传统方法相比，具有需样品量少，简单快速，灵敏度高，周期短等优点。该实验以人血管内皮细胞膜色谱模型指导红毛七的分离和筛选，快速地找到红毛七中与血管内皮细胞膜及膜受体有相互作用的活性部位H M Q B - 2 ，经M T T 试验确定删Q B 一2 有抑制血管内皮细胞增殖的作用，为进一步研究红毛七的药用价值、质量控制和体内分析奠定了基础。应用细胞膜色谱模型明显缩短了天然植物中活性物质的筛选时间，同时以不同靶细胞膜色谱模型进行筛选，可以非常方便的进行一药多筛，实现快速的药物筛选。金刷把中细胞毒性成分的筛选及其对H e L a 细胞生长影响的研究张博贺浪冲( 西安交通大学天然药物研究与工程中心陕西西安7 2 1 0 0 6 )金刷把( C l a d o n i af a l l a xA b b a y e s ) 为石蕊科植物松石蕊的全体，属于寄生地衣植物，主要分布陕西、四 川等地，具有镇静、消炎、止痛的功能，主治癫痫、精神分裂、神经衰弱、头目眩晕等症，是一种陕西民 间用的中草药。近年来的研究表明，细胞膜可以作为抗癌药物的一种新型靶点，可反映出药物分子与细胞膜及膜受体的某种作用关系，文献报道以红细胞作为研究对象的较多。据此笔者以细胞制成细胞膜色谱柱( c e l lm e m b r a n es t a t i o n a r yp h a s e 。C M S P ) ，利用液相色谱法进行大量药物筛选，并以阿霉素作为对照，利用 M T T 比色法验证药理作用。l仪器与试药 1 1 仪器 热电色谱仪器( 美国) ：S p e c t r a S Y S T E MP 2 0 0 0 溶剂输送泵、S p e c t r a S E R I E SU V l 0 0 检测器，A N A S T A R 色谱工作站( 法国) ；H e r m e l2 k4 0 1 型低温冷冻高速离心机( 德国) ；二氧化碳培养箱( H e r a e u s ) ；无菌工作台( 苏 州安泰公司) ；倒置显微镜( X D S I B ) ；B I O R A D 5 5 0 型自动酶标读数仪；9 6 孔培养板。 1 2 试药甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亚砜等均为分析纯( 西安化 学试剂厂) ；M T T ，R P M l l 6 4 0 ，胰蛋白酶( 华美公司) ，阿霉素( 西安交通大学第一医院药剂科) ，三蒸水( 自 制) 1 - 3 实验所用的动物及细胞株 健康家兔，雌雄不限( 西安交通大学实验动物中心) ；H e L a 细胞株( 西安交通大学免疫病理教研室馈赠) 2 原药材的提取分离 2 1 对原药材的初步分离取原药材2 k g ，粉碎成粗粉，用9 5 乙醇加热回流提取2 次，每次3 小时，合 并提取液，回收乙醇至无醇味，加水适量，分别以石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到J S B l ， J S B 2 ，J S B 3 ，J S B 一4 ，J S B 5 共5 个部分，经细胞膜色谱法筛选得出J S B 一2 有保留( 见图1 ) ，是其中可能含 活性成分的部位。 2 2 对乙醚部位J S B 2 进一步分离 以柱层析硅胶为填料，湿法装柱并用洗脱液平衡柱，将J S B 一2 用硅胶拌样后上柱分离，采用氯仿甲醇 下行洗脱，经薄层色谱等各种跟踪分析后，最终得J S B 一2 A ，J S B 2 B 两份样，经筛选后得出J S B 2 A 是其 中可能含活性成分的部位。对J S B 一2 A 又进行柱层析分离，以正己烷乙酸乙酯作为洗脱剂，得到 J S B 2 A 1 - J S B 一2 A 1 0 共1 0 份样，经C M C 色谱筛选得出J S B 一2 A 1 ( 黄色) ，J S B 一2 A 2 ( 红色) ，J S B 2 A 3 ( - 1 - _ 红色) 为有保留部位，显示出其中可能含活性成分。2 3J S B 2 A 2 的纯化 取J S B 一2 A 2 适量，以氯仿进行结晶，得到一种结晶，再多次重结晶得到白色片状结晶体( G ) ，经筛选 该物质有保留，显示其可能具有活性。见图2 。