烟草转枇杷e j L F Y植株的P C R 检测宋虎卫刘月学胡桂兵林顺权( 华南农业大学园艺生物技术研究所广州五山5 1 0 6 4 2 )利用本课题组刘月学等克隆到的两个与成花相关的基因，分别构建了含e j L F Y和e j A P l 的植物表达载体，并转入到农杆菌中，为功能鉴定提供了可能。用该基因转化烟草，经P C R 鉴定得到了多株转基因材料。主要结果如下：烟草的叶片比较薄，在农杆菌中不宜浸泡太长时间。烟草的诱芽比较容易，放于诱芽培养基上的外植体，两周左右可以看到愈伤组织长出。愈伤组织长出后两周左右，可以看到有不定芽长出。外植体出愈率和愈伤组织出芽率可以达到1 0 0 ( 图1 ) 。不定芽从愈伤组织上切下，置于诱根培养基中诱导根的生长，如图1 所示。烟草生根较容易，诱根后一周左右就可以看到根的生成。根长出后，将小植株移到蛭石中，组培室中生长两周左右，揭开封口膜，炼苗一周后移栽到营养土中( 如图l所示) ，在温室自然光照下生长。图1 烟草不定芽的诱导和转基因植株再生移栽的材料提取基因组D N A 后，经3 对引物的P C R 检测，结果如下图( 图2 )所示。从图中可以看出，检测K a n 抗性的K A N 引物P C R 检测( 图中A 层结果) 中，3 、4 、6 、7 、8 、9 、1 3 、1 4 、1 5 、1 7 、1 9 、2 0 、2 1 泳道中出现目的带，说明这些泳道的源材料可能是转基因植株；检测e j L F Yc D N A 全长序列的引物扩增结果( 图中B 层结果) 中，3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 2 、1 3 、1 4 、1 5 、1 7 、1 9 、2 0 、2 1 泳道中出现目的带，综合K A N 引物检测结果可以初步表明，泳道3 、4 、6 、7 、8 、9 、1 3 、1 4 、1 5 、1 7 、1 9 、2 0 、2 1 的源材料为转基因植株；而A G R I S 检测表明，除了阳性对照外，其余阴性对照及所有材料都没有扩增出目的带( 图中C 层结构) ，这说明，我们上述两个引物的P C R 结果为正常的植物材料检测结果，而非转基因用农杆菌污染所致。因此，我们认为得到的材料中，泳道3 、4 、6 、7 、8 、9 、1 3 、1 4 、1 5 、1 7 、1 9 、2 0 、2 1 的源材料是真正的转基因植株，e j L F Y 基 已经成功的转入了上述材料中。图23 对引物检测转基因植株情况其中A 层为I C O N 引物检测K 觚抗性结果；B 层结果为检测目的基因e j L F Y 结果；C 层为检测农杆菌特有的C h v A 基因检测结果。各层中，M 为D L 2 0 0 0 ，1 是阳性对照，为G V 3 1 0 1 - p B l l 2 1 一L F Y 菌液；2 为阴性对照；3 - 2 1为待测植株。对e j L F Y 转化烟草的实验初步鉴定认为得到了多株转基因烟草材料，但烟草的开花习性目前为止没有发现改变，是否是该基因并没有单独促进开花的特性( 象结构功能预测中提到的那样) ，需要与其它因子共同作用才可以表现出其生物学功能或者是由于转基因沉默造成的，需要做进一步的研究。另外，P C R 检测鉴定的结果需要结合其它实验如分子杂交等作进一步的验证。