植物病理学报 A C T AP H Y T O P A T H O L O G I C AS I N I C A3 5 ( 6 ) ( Z K ) ：1 7 6 1 7 8 ( 2 0 0 5 )生防菌株M e n m y c o 一9 3 6 3 液体培养代谢特性初探张艳，孟庆芳，杨文香，刘大群+ ，李亚宁，张立荣，张汀( 河北农业大学植物保护学院，河北省农作物病虫害生物防治工程技术中心，保定0 7 1 0 0 1 )M e t a b o l i s mi nl i q u i dc u l t u r em e d i u mo fs t r a i nM e n 。m y c o - 9 3 - 6 3Z H A N GY a n ，M E N GQ i n g f a n g ，Y A N GW e n x i a n g ，L 1 UD a q u n ，L IY a n i n g ，Z H A N GL i r o n g ，Z H A N GT i n g( C o l l e g eo fP l a n t1材料和方法1 3 3 氨基氮测定方法氨基氮的测定采用甲醛1 1供试菌株1 f t 4 J 3 A t _ 4 t Z x ”生物量测定取发酵液稀释，以空白培养链霉菌M e n m y c o - 9 3 - 6 3 2 | ，由河北农业大学基等倍稀释为对照，测定其在5 5 0a m 下的吸光植物病害生物防治研究室提供。度值。1 2 培养基和培养方法赫羔；p H 测定用H A N N A p 型p H 剂1 2 1培养基发酵培养基：3 淀粉，1 葡萄1 3 6 抗生素效价测定方法抗生素活性采用生糖，2 蔗糖，0 0 2 果糖，2 o 花生饼粉，0 5 物法测定辅以色谱检测。发酵液离心，得到菌体沉纂a C l , n 0 2 酵聃叭爨一赢鬣娶勰篇淼茎器K H 2 P 0 4 ，v 1 3 ：_ “ ) = ：K c 7 n0 7 N H ) 2S 0 400 7 0 2 C a C O s , O F e S 0 4 , 0 薪：善崔茬篡甬蓑三磊葚嚣川6 ”斗“m 9 7 F 汹8 状m ”m “x Z n S O 。P H 自然。3 0 0 蛐n ，流速为2 o 山I I l i n ，上样量2 仙L ，柱温为 1 2 2 培养方法每1 0 01 1 1 L 培养基接种1m L室温。用3 0 一8 0 一1 0 0 甲醇梯度浼脱。孢子悬液浓度：羹霪霎) 氖, 装A5 0 砷。萎耄鬈警2结果与讨论30。(22 0 0，r m i n 振荡培养，每1 2h 取样检测代谢钥不1 屺情况。2 1 液体培养形态1 3代谢特征测定方法从液体培养形态变化可以看出，M e n m y c o - 9 3 一l 3 1 菌体形态观察方法发酵液用美蓝染色，发芽，长出分枝，分支旺盛而生长成一个菌丝团，美 制成水封片，显微观察。蓝着色呈深蓝色。第期，菌丝团散开，主体菌丝 1 3 2 糖测定方法糖的测定采用3 ，5 _ 二硝基水两侧的次生菌丝生长延长而交织成网状，美蓝染色 杨酸( D N S ) 法旧1 。发酵液离心后取上清液，稀释呈深蓝色，后期美蓝着色趋浅。第1 1 1 期，菌丝趋短后测定还原糖含量；上清液加盐酸水解，稀释后测或中长。第1 V 期，菌丝形态模糊，自溶。收稿日期：2 0 0 5 0 5 - 0 7 ；修回日期：2 0 0 5 1 1 一1 8 基金项目：国家“八六三”资助项目( 编号：2 0 0 3 A A 2 4 1 1 3 0 ) 通讯作者：刘大群，男，教授，博士生导师，主要从事植物病害生物防治的研究；E m a i l ：l d q m a i l h e b a u e d u c n6 期( 增刊)张艳，等：生防菌株M e n m y c o - 9 3 - 6 3 液体培养代谢特性初探1 7 7一一些代谢废物，不利于抗生物的提取，判断此时为发酵终点。整个过程中p H 持续上升，1 2 0h 时达到7 1 3 ，发酵过程中监测p H 值的变化可以作为判断发酵终点的一个指标。F i g 1C o n f i g u r a t i o no fM e n m y c o - 9 3 - 6 3a f t e rb e i n gc u I t u r e df o r4 8h ( 4 0 0 )F i g 2C o n f i g u r a t i o no fM e n m y c o - 9 3 - 6 3a f -t e rb e i n gc u l t u r e df o r7 2h ( 4 0 0X )嘈卜0 D 5 5 0十p HN i l r o g e n ( m g 1 0m L )* 一T o t a ls u g 盯( m g m L ) 一D e o x i d i z e d 翮窖口m 函I ，)F i g 5F e r m e n t a t i o nm e t a b o l i s mc u r v eo fM e n m y c o - 9 3 - 6 3F i g 3C o n f i g u r a t i o no fM e n m y c o - 9 3 - 6 3a f -t e rb e i n gc u l t u r e df o r9 6h ( 4 0 0 )2 3 对蒸馏物的色谱检测结果色谱检测表明抗生素在代谢过程中成分稳定，主峰出峰时间在3 2 l ”一3 2 8 ”之间。F i g 4C o n f i g u r a t i o no fM e n m y c o - 9 3 - 6 3a f -t e rb e i n gc u l t u r e df o r1 5 6h ( 4 0 0X )2 2 摇瓶代谢情况从图5 可以看出，发酵前期随着菌体生长，氨基氮和糖含量逐渐降低，2 4h 到7 2h 菌体生长量增幅最大，认为为对数生长期，糖和氮也随之有很大幅度的降低。发酵7 2h 菌体达到最大生长量。发酵1 2 0h 后糖利用减慢，氨基氮开始回升，分析认为末期菌体白溶释放出自身的部分氨基酸所致。发酵3 6h 后开始产生抗生素，1 2 0h 时达到最大量，继续发酵产量略有减少，认为继续培养会产生售亘13 2 5 l；萋喜1 裟I疆焉姨焉蒜从代谢曲线中看出，培养基中的碳源和氮源在发酵末期都过剩，有必要对培养基进行改良；菌体的生长和抗生素的产生并不同步，在以后的实验中应明确适于生长和抗生素产生的不同培养条件，为发酵放大奠定基础。钙知”如筋加：2 m5 o1 7 8植物病理学报3 5 卷参考文献 1 刘大群，杨文香，祁碧菽，等拮抗链霉菌M e n m y c o 一9 3 - 6 3 及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响 J 河北农业大学学报，1 9 9 9 ，2 2 ( 4 ) ：1 2 7 1 3 0 2 M e n gQF ，Y a n gWX ，Z h a n gQL ，e ta 1 F i e l de v a l u a t i o no fa n t a g o n i s t i cS t r e p t o m y c e sM e n m y c o - 9 3 - 6 3p r e p a r a t i o ni nb i o c o n t r o lo fc o t t o nv e r t i c i l l i u m w i l tA P r o c e e d i n g so ft h e1 5 mI n t e r n a t i o n a lP l a n tP r o t e c f i o nC o n g r e s s C B e i j i n g ：F o r e i g nL a n g u a g e sP r e s s ，2 0 0 4 1 5 3 3 张龙翔，张庭芳生物化学实验方法与技术 M 北京：高教出版社，1 9 9 7 1 3 斗g 斗e 砷绯e 斗e 斗枣碍枣斗e 斗e 斗窜斗台斗g 拍! 斗e 斗枣斗窜斗e 斗e 斗e f 斗辜斗枣斗g 井e 斗皋艇! 斗g 斗枣斗皋* 搴斗台斗啾斗皋斗g 斗e 斗辜* 鲁斗e ) 悖斗皇牛窜斗e 斗窜膏台植物病理学报) 2 0 0 5 年第6 期( 增刊)审稿人名单( 排名不分先后) ：曹克强韩成贵于嘉林李明福 彭德良王宗华赵美琦柴敏何朝族郭泽建李世东 钱韦吴学宏赵廷昌陈怀谷何晨阳王海光李世访裘季燕肖悦岩赵文生陈剑平何祖华刘鹏飞李向东田国忠徐世昌周常勇陈万权 洪健李宝聚 粱五生王慧敏 徐同周立刚编辑人员名单( 排名不分先后) ：于金枝杨晓昱董萍邹菊华杨莉东秀珠黄丽丽李大伟廖金铃 王琦许志刚周明国董金皋简桂良李洪连刘润进 王文桥杨希才周雪平段霞瑜简恒李华平刘西莉王锡锋 张国珍周益林范在丰姜子德李怀方刘杏忠 王晓呜张力群朱水芳冯洁康振生李健强马平 王源超张忠军朱小琼冯兰香国立耘李金云潘庆华王振中 张仲凯庄剑云