机械性创伤诱发大鼠肺泡机械性创伤诱发大鼠肺泡型上皮细胞凋亡机制研究型上皮细胞凋亡机制研究山西医科大学博士学位论文机械性创伤诱发大鼠肺泡型上皮细胞凋亡机制的研究姓名:戴文娟申请学位级别:博士专业:呼吸内科指导教师:刘卓拉2011-05-10 山西医科大学博士学位论文 机械性创 伤诱发 大鼠肺泡 型上 皮细胞凋 亡机制 的研究摘 要 研究目 的: 1 建立机械性创伤大鼠模型;TNF-a、肾上腺素损伤大鼠模型;拉贝洛尔干预大鼠模型。 2 观察机械性创伤时肺组织中 FoxA1 mRNA 和蛋白质的表达改变及肺组织中肺泡型上皮细胞的凋亡。 3 观察 TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡型上皮细胞 FoxA1 mRNA、蛋白质表达的影响及大鼠肺泡型上皮细胞的凋亡。 4 研究 TNF-a、肾上腺素对大鼠肺组织中 FoxA1 mRNA、蛋白质表达的影响及大鼠肺泡型上皮细胞的凋亡。 研究方 法: 1 机械性创伤对大鼠肺组织 FoxA1mRNA 和蛋白及大鼠肺泡型上皮细胞凋亡的影响 建立非致死性机械性创伤模型:麻醉大鼠后,将其置于 Noble-Collip 创伤仪(直径 12英寸),以 40 rpm 的转速,旋转 200 圈,造成大鼠非致死性创伤。以 ELISA 法检测大鼠血清中 TNF-a、肾上腺素含量;使用实时荧光定量 PCR 和免疫蛋白印迹检测创伤组和伪创伤组大鼠肺组织 FoxA1 mRNA 的表达的变化;对大鼠肺组织切片进行 TUNEL和肺泡型上皮细胞特异性标志物 SP-C 染色检测大鼠肺组织中凋亡的肺泡型上皮细胞。 2 TNF-a、肾上腺素体内实验对肺泡型上皮细胞的影响 建立 TNF-a、肾上腺素损伤离体细胞模型:100ng/mlTNF-a 和 2000ng/ml 盐酸肾上腺素刺激大鼠肺泡型上皮细胞。运用荧光定量 PCR、免疫蛋白印迹检测 TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡型上皮细胞 FoxA1 mRNA、蛋白质表达,同时运用流式细胞术检测大鼠肺泡型上皮细胞的凋亡。3 TNF-a、肾上腺素体内实验对肺泡型上皮细胞的影响 建立 TNF-a、肾上腺素损伤大鼠模型:向大鼠腹腔分别注射 TNF-(2.5ug/kg)、盐酸肾上腺素(1ml/kg);拉贝洛尔干预模型:在给大鼠灌胃盐酸拉贝洛尔后 3h、6h、24h 后再放入 Noble-Collip 创伤仪以 40 r/min 转动 200 圈造成机械性创伤。运用免疫蛋白印迹检测这三种模型中大鼠肺泡型上皮细胞 FoxA1 蛋白质表达,通过 TUNEL 和 SP-C 免疫组化染色对比,检测大鼠肺组织中肺泡型上皮细胞的凋亡,同时运用 ELISA 法检测三种大鼠模型中血清中 TNF-a、肾上腺素含量。 研究结 果: 1 机械性创伤对大鼠肺组 织 FoxA1mRNA 和 蛋白及大鼠 肺泡 型 上皮细胞凋亡的影 响 1.1 机 械性 创伤 对大鼠分 泌肾 上腺素 和 TNF- 的 影响 以 ELISA 法检测大鼠血清中 TNF-a、肾上腺素含量,创伤后各时间点血清中肾上腺素I 山西医科大学博士学位论文 和 TNF- 含量逐渐上升,分别于创伤后 6h 和 3h 达高峰,峰值为(1.75600.1311)ng/ml和 135.08981.5349ng/l,差异有统计学意义(P0.01) 1.2 机 械性 创伤 致继发性 肺损 伤对 FoxA1 mRNA 和 蛋 白质 表达的 影响 使用实时荧光定量 PCR 和免疫蛋白印迹检测创伤组和伪创伤组大鼠肺组织 FoxA1 mRNA 的表达的变化。结果显示创伤组 FoxA1 mRNA 表达较伪创伤组增高,FoxA1 蛋白表达在创伤组均高于伪创伤组,于创伤后 24h 达到高峰(P0.01)。 1.3 机 械性 创伤 对大鼠肺 泡 型上皮 细胞 凋亡的 影响 TUNEL 和肺泡型上皮细胞特异性标志物 SP-C 染色结果表明大鼠创伤后出现肺泡型上皮细胞凋亡。 2 TNF-a 、肾上 腺素对离 体大鼠肺泡型上 皮细胞的影响 2.1 TNF-a、 肾 上 腺素对 大鼠 肺泡 型上 皮细胞 FoxA1mRNA 的 表 达 影响 使用实时荧光定量 PCR 和免疫蛋白印迹检测各组大鼠肺泡型上皮细胞 FoxA1 mRNA和蛋白质的表达的变化。结果显示盐酸肾上腺素、TNF-a 刺激后 FoxA1mRNA 和蛋白表达明显上升,24 小时达到高峰。差异有统计学意义(P0.01)。 2.2 TNF-a、 肾 上 腺素对 肺泡型上 皮细 胞凋亡 的影 响 采用流式细胞术检测了 100ng/mlTNF-a 和 2000ng/ml 盐酸肾上腺素刺激大鼠肺泡型上皮细胞后的凋亡率,结果表明,两组刺激 12 小时后大鼠肺泡型上皮细胞凋亡率显著上升,与对照组比较差异有统计学意义。 3 TNF-a 、肾上 腺素体内实 验对肺泡型上皮 细胞的影响 3.1 TNF-a、 肾 上 腺素对 肺泡型上 皮细 胞的影 响 使用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测各组 FoxA1 蛋白的表达情况,结果显示,FoxA1 蛋白表达在 TNF-a 注射组、盐酸肾上腺素注射组均高于生理盐水对照组,于创伤后6h 达到高峰,差异有统计学意义(P0.01) 以 ELISA 法检测大鼠血清中 TNF-a、肾上腺素含量,结果显示,TNF-a 注射组、盐酸肾上腺素注射组与生理盐水对照组相比含量明显增高,差异有统计学意义(p0.01) TUNEL 和肺泡型上皮细胞特异性标志物 SP-C 染色结果表明腹腔注射 TNF-a、盐酸肾上腺素出现肺泡型上皮细胞凋亡,并且于 12 小时到达高峰。 3.2 拉 贝洛 尔对 大鼠肺泡型 上皮细 胞的 影响 以 western blot 检测(-actin 为内参对照)各组中 FoxA1 蛋白的表达情况,FoxA1 蛋白表达在盐酸拉贝洛尔灌胃组均低于创伤组,差异有统计学意义(P0.01)。 血清中肾上腺素含量的检测结果:拉贝洛尔干预组与创伤组相比含量明显降低,差异有统计学意义(p0.01);血清中 TNF- 含量的检测结果:拉贝洛尔干预组与创伤组相比含量显著明显降低,差异有统计学意义(p0.01)。 TUNEL 和肺泡型上皮细胞特异性标志物 SP-C 染色结果表明拉贝洛尔干预组与创伤组相比肺泡型上皮细胞凋亡明显减少。II 山西医科大学博士学位论文 研究结 论: 1 机械性创伤使大鼠血清中 TNF-a、肾上腺素水平显著升高并且大鼠肺组织中 FoxA1 表达上调,导致肺泡型上皮细胞凋亡。 2 TNF-a、肾上腺素刺激的肺泡型上皮细胞中 FoxA1 表达上调。FoxA1 在 TNF-a、肾上腺素诱导的肺泡型上皮细胞凋亡中具有重要作用。 3 肾上腺素、 TNF-a 水平增高引起的肺损伤类似于机械性创伤所导致的继发性肺损伤,并且出现肺泡型上皮细胞凋亡。4 拉贝洛尔可以通过抑制交感神经活性减少肾上腺素的释放,降低 TNF-a 的水平,减少肺泡型上皮细胞凋亡从而减轻机械性创伤所导致的继发性肺损伤。5 机械性创伤可以引起机体 TNF-a、肾上腺素水平升高,其中 TNF-a 、肾上腺素又有相互促进作用,加重肺损伤程度,使肺泡型上皮细胞凋亡。 6 拉贝洛尔对机械性创伤导致的继发性肺损伤有保护作用。关键词:机械性创伤;继发性肺损伤;细胞凋亡;肺泡型上皮细胞;FoxA1; 肿瘤坏死因子-a;肾上腺素III 山西医科大学博士学位论文 Mechanism of mechanical trauma induces type penumonocyte apoptosisi in ratsAbstract Objects: 1. Establishment of Non-lethal Mechanical trauma MT model and pulmonary injury model in rats. To establish labetalol intervention rats model using labetalol2. Non-lethal MT model was used to detect mRNA and protein expression of FoxA1 in pulmonary tissues and typepenumonocyte apoptosis3. Cell model in vitro was used to detect the effects of TNF- and epinephrine on mRNA and protein expression of FoxA1 in pulmonary tissues and typepenumonocyte apoptosis4. pulmonary injury model was used to detect detect the effects of TNF- and epinephrine on mRNA and protein expression of FoxA1 in pulmonary tissues and typepenumonocyte apoptosisMethods: 1.The effects of MT on mRNA and protein expression of FoxA1 in pulmonary tissues and typepenumonocyte apoptosisEstablishment of Non-lethal Mechanical trauma MT model in rats. After anesthetized, rats were placed in a Noble-Collip drum 12-in.-diameter and subjected to 200 revolutions at a rate of 40 rpm to induce a non-lethal MT. TNF and epinephrine levels were observed by ELISA method. Expression of FoxA1 was detected by RT-PCR and western-blotting in MT group and control group. TUNEL and anti-SP-C staining were used to measure typepenumonocyte apoptpsis in rat lung tissue following mechanical trauma2. The effects of TNF and epinephrine on mRNA and protein expression of FoxA1 in typepenumonocyte in vitro Establishment of pulmonary injury model in typepenumonocyte ,Expression of FoxA1 was detected by RT-PCR and western-blotting in groups. Apoptosis rate of typepenumonocyte after 100ng/mlTNF- and 2000ng/ml epinephrine induction was detected by flow cytometry3. The effects of TNF and epinephrine on typepenumonocyte in vivo Establishment of TNF- , epinephrine injury rat model : Rats were injected intraperit