专题发言论断与基础研究诊断与基础研究分子遗传学技术在软组织肿瘤诊断中的应用孙保存天津医科大学肿瘤研究所天津市3 0 0 0 6 0天津医科大学病理学教研室天津市3 0 0 0 7 0分子遗传学是研究基因的活动和功能的科学。近二十年来，分子遗传学技术发展极为迅速，并对其它生物学领域产生了巨大的影响。尽管形态学依然是诊断病理学的基础，但分子遗传学的结果已愈来愈多地参与外科病理诊断。大量文献已经证实，除癌基因和肿瘤抑制基因的点突变外，染色体易位和丢失所致的基因重排和丢失也是软组织肿瘤发生的重要分子机制【。使用分子遗传学技术检测染色体和基因的变化，对软组织肿瘤的诊断有重要意义。一、分子遗传学技术分子遗传学技术主要用于分析病变组织和细胞核酸的变化，包括：分子杂交：斑点杂交、S o u t h e r n 、N o r t h e r n 杂交和原位杂交；靶位点基因扩增技术：P C R 、R T P C R和实时P C R ；探针扩增技术：I n v a d e r 分析；信号扩增方法：b r a n c h e dD N A ( b D N A )分析；基因芯片技术。病理科常规诊断工作中应用最多的方法是荧光原位杂交、P C R和R T P C R 。1 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，F I S H )F I S H 技术是利用荧光标记的核酸分子作为探针，经变性解链后，在适当条件下与细胞内互补的核酸分子进行杂交，从而检测后者存在的情况以及数量、结构等变化的一种方法。其操作步骤见图l 。F I S H 探针有以下3 种：整条染色体探针，又称染色体涂染探针，用于检测分裂细胞中的染色体结构畸变和标记染色体；着丝粒特异性探针，用于检测间期和中期细胞中的非整倍体；位点特异性探针，用于检测特异性染色体易位和基因异常。探针标记分为直接标记和间接标记。直接标记就是将异硫氰酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，专题发言论断与基础研究F I T C ) 、罗丹明( r h o d a m i n ) 等荧光染料直接与探针相连。间接标记法是先在探针上接一种半抗原，再使用能够同半抗原特异结合的带荧光标记的蛋白对其进行检测。半抗原有生物素、地高辛、三硝基苯( T N P ) 和汞等。标记方法多用缺口平移、随机引物标记和P C R 扩增法。F I S H 探针现已广泛应用并有许多商品化产品，已经成为许多疾病病理诊断不可缺少的工具。F I S H 技术不仅能够用于中期染色体和间期细胞核，而且可以在组织切片上操作，将分子遗传学变化与形态学结合起来，为病理医师提供可见的诊断依据。F I S H 现已成为国外许多病理实验室的常规工作，为临床病理诊断提供帮助。2 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R )P C R 是由K e r r yM u l l i s 在1 9 8 5 年提出的，可使核酸序列无限制扩增的一项技术。应用此技术，一个D N A 片段可从单一拷贝复制百万倍，从而能够有效地用于疾病基因分析。P C R 是一个简单的化学反应，每个循环主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。每个循环结束后，P C R 产物都成为双倍。P C R 需要下列原料：靶D N A 模板、寡核苷酸引物、镁离子、d N T P s 和D N A 聚合酶等。一般情况下，寡核苷酸引物有两个，多为1 7 3 0 个碱基或稍长的单链，分别与靶D N A 模板上游和下游的D N A 序列互补。现在许多引物已经商品化或者可以在生物公司合成。扩增产物的检测，一般是对双链D N A 进行染色后通过凝胶电泳分离各自条带。P C R 的优势，在于应用一个简单的工具去获得我们希望得到的特异性基因或D N A 区段，而这些特异性产物来自寡核苷酸( 引物) 引导合成的D N A 序列。实时P C R ( r e a l t i m eP C R ) 能够实时对P C R 产物进行定量分析。之所以被许多临床实验室所青睐，因为其无须电泳检测步骤，可减少标本操作；同时对防止扩增物污染的要求较低。许多临床病理实验室发现实时P C R 尤其适用于感染性疾病的基因诊断，因其可避免有害病原体的播散。3 反转录聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T P C R )R T P C R 是将R N A 反转录为c D N A ，然后再进行扩增，其操作流程见图2 。在诊断病理实验室中，R N A 作为模板比D N A 模板应用更为广泛，因为它能直接反映基因表达水平的异常。因R T P C R 很敏感，可检测低水平病变细胞的基因异常变化，对于疾病的诊断和治疗监测十分有用。但是R N A 容易降解，所提取的R N A 的质量是R T P C R 能否成功的关键。这限制了R T P C R 技术在福尔马林固定、石蜡包埋组织中的应用。随着R N A提取技术的发展和石蜡包埋组织R N A 提取试剂盒的出现，现在已经能够从石蜡包埋组织中提取到高质量的R N A ，因此R T P C R 在临床病理诊断中的作用日益受到重视。上述分子遗传学技术可在周围血、体液、细针穿刺标本、新鲜标本和石蜡包埋组织等各种标本中进行研究实验【2 。4 】，大大推动了诊断病理学的发展。二、分子遗传学技术在软组织肿瘤诊断中的应用软组织肿瘤是起源于纤维组织、脂肪组织、肌组织、脉管、滑膜和间皮等的非上皮性专题发言论断与基础研究骨外组织的肿瘤，其种类繁多，目前仅W H O 正式命名的软组织肿瘤就达两百多种。由于某些软组织肿瘤形态差异不是很大，特别是一些分化程度较低的圆形、卵圆形或梭形细胞肿瘤，有时即使借助免疫组化和超微结构仍不能确定其类型，给临床诊断带来很大困难。但是，与上皮性肿瘤的发生、发展需多个基因变化的参与不同，软组织肿瘤一般只显示一步或少数遗传学改变。因此，分子遗传学技术对于某些软组织肿瘤具有诊断意义。1 脂肪肉瘤【5 】粘液性脂肪肉瘤是最常见的一型脂肪肉瘤，7 7 一9 6 的病例中存在染色体易位t ( 1 2 ；16 ) ( q 13 ；P11 ) ，导致12 q 13 转录因子基因D D I T 3 ( D N A d a m a g e i n d u c i b l et r a n s c r i p t3 ，也称C H O P ) 与1 6 p 1 1 的F U S ( f u s i o ng e n e i nm y x o i dl i p o s a r c o m a ，也称T L S ) 基因融合。应用F I S H技术检测t ( 1 2 ；1 6 ) ( q 1 3 ；P 11 ) ，R T P C R 技术检测融合基因C H O P F U S ，对于粘液性脂肪肉瘤的诊断和鉴别诊断有重要意义。分化良好型脂肪肉瘤的分子遗传学改变有1 2 号染色体形成环状染色体和( 或) 巨大标记染色体。但这种改变在其他一些软组织肿瘤如恶性纤维组织细胞瘤中亦可见到，在诊断上只具有一定的参考价值。多形性脂肪肉瘤的分子遗传学改变则比较复杂，包括多克隆染色体异常，其在诊断中的作用有待进一步研究。2 横纹肌样瘤【6 】9 0 以上横纹肌样瘤存在2 2 q 缺失，导致抑癌基因I N l l 失活，其编码蛋白质具有参与染色体重建的作用，通常这是横纹肌样瘤唯一的分子遗传学改变，故具有诊断作用。3 横纹肌肉瘤【7 】8 0 以上的腺泡状横纹肌肉瘤中存在t ( 2 ；13 ) ( q 3 5 ；q1 4 ) 染色体易位，导致13 号染色上的F K H R ( f o r k h e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 基因和2 号染色体上的P A X 3 ( p a i r e db o xh o m e o t i cg e n e3 ) 基因融合，形成F K H R P A X 3 融合基因。另有1 0 2 0 的病例中存在t ( 1 ；1 3 ) ( p 3 6 ；q 1 4 ) ，F K H R 基因和1 号染色体上的P A X 7 ( p a i r e db o xh o m e o t i cg e n e7 ) 基因融合形成F K H R P A X 7 。而胚胎型横纹肌肉瘤和其他恶性肿瘤中均未见这两种特征性的染色体易位或基因融合，对腺泡状横纹肌肉瘤有诊断意义。4 滑膜肉瘤滑膜肉瘤是一类起源未定的恶性软组织肿瘤，好发于青壮年男性。根据肿瘤的细胞组成和分化程度可分为四种组织学类型：双相型、单相纤维型、单相上皮型和低分化型，前两种较常见。9 0 以上的滑膜肉瘤中存在染色体易位t ( X ；l8 ) ( p l1 ；q l1 ) ，导致sY T( s y n o v i a ls a r c o m at r a n s l o c a t i o n ，c h r o m o s o m e18 ) 与S S X ( s y n o v i a ls a r c o m a Xb r e a k p o i n t ) 基因融合。由于断裂点的不同，S S X 基因可分为几种亚型，以S S X l 和S S X 2两种较为常见。研究表明，融合基因的类型与滑膜肉瘤的组织学类型和预后相关。S Y T S S X l 多见于双相型，S Y T S S X 2 多见于单相型；与前者相比，后者的增殖活性更低，预后更好 8 9 1 。国内有报道采用R T P C R 方法可从石蜡包埋组织中检出S Y T S S X 融合基因D o ，诊断阳性率与国外文献报道基本一致。5 隆突性皮肤纤维肉瘤】5 7专题发言论断与基础研究隆突性皮肤纤维肉瘤多见于成年人，术后复发率高。其特征性改变是除正常核型外出现大量由1 7 、2 2 号染色体形成的环状染色体，这一改变在其它肉瘤中尚未发现，具有诊断标志物的作用。1 7 号染色体上的胶原基因( ac o l l a g e ng e n e ，C O L I A l ) 与2 2 号染色体上的血小板源性生长因子B ( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r bg e n e ，P D G F B ) 基因融合。此外，较罕见的是17 和2 2 号染色体的平衡易位，同样形成C O L lA 1 P D G F B 融合基因。这一易位还见于巨细胞纤维母细胞瘤，这支持巨细胞纤维母细胞瘤是隆突性皮肤纤维肉瘤幼年型的说法。6 先天性或婴儿性纤维肉瘤12 先天性或婴儿性纤维肉瘤是指5 岁以下个体发生的纤维肉瘤，预后较成人好。特征性的分子遗传学改变有8 、11 、1 7 和2 0 号染色体三体及染色体易位t ( 1 2 ；1 5 ) ( p 1 3 ；q 2 6 )导致的E T V 6 ( e t sv a r i a n tg e n e 6 ) 基因与N T R K 3 ( n e u r o t r o p h i c t y r c - i n ek i n a s er e c e p t o rt y p e3 ) 基因融合。中胚层肾瘤也存在t ( 1 2 ；1 5 ) 染色体易位和11 号染色体三体，与先天性或婴儿性纤维肉瘤在发病、形态，临床特征上极为相似，很可能是同一个肿瘤实体发生在不同部位的表现。7 尤因肉瘤和原始神经外胚层肿瘤 13 , 1 4 尤因肉瘤( E w i n g Ss a r c o m a