药物分析杂志巫山淫羊藿的指纹图谱及相似度计算方法的考察+吉红梅周颖新孙文基( 西北大学陕西省生物医药重点实验室西安7 1 0 0 6 9 )巫山淫羊藿阻w u s h a n e n s eT S Y i n g ) 是中国药典淫羊藿所属的一个种，主产于四川、陕西、湖北的等地。各种淫羊藿药材叶形相似，通过形态鉴别使巫山淫羊藿得以区分，较为困难。我们初步研究了巫山淫羊藿的指纹图谱，目的在于和其它种淫羊藿相区别。现多用相似度对比软件来判别中药指纹图谱相似度，相似度对比软件对指纹图谱的数据处理主要有两个关键因素，一是电信号的处理，二是采用的计算方法。计算方法有相关系数( 包括中位数相关系数法、均值相关系数法) ，夹角余弦法，模糊相关法等。不同的算法适用于不同的品种。1 仪器与试剂H I T A C H I 高效液相色谱仪，包括L 一7 1 1 0 恒流泵，L 7 4 2 0 紫外检测器；超声波清洗器；乙腈为F i s h e r色谱纯，其他试剂均为分析纯。水为高纯水。巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿样品由陕西省安康地区药品检验所中药室提供，经朱朝德主任药师分类学鉴定分别为Ew u s h a n e n s eT S Y i n g 、Es a g i t t a t u m ( s i e b E tZ u c c )M a x i m 的干燥植物体。淫羊藿购自西安药材市场，并经谢志民主任药师分类学鉴定为E b r e v i c o r n u mM a x i m 的干燥植物体。柔藿苷和淫羊藿苷对照品均由中国医学科学院北京药物研究所贾敏鸽同志提供。使用中南大学、西北大学相似度计算软件。2 方法2 1 液相色谱条件：流动相为乙腈水( 2 5 ：7 5 ) ；检测波长2 7 0 n m ；流速l m L m i n 一。2 2 供试品制备：分别取药材( 过4 0 目筛) 约2 9 精密称定。加入2 0 m L 稀乙醇于具塞锥形瓶中，称定其质量，于超声波清洗器间隙超声3 0 m i n 。加入稀乙醇补足损失的重量，摇匀，滤过，再用0 4 51 tm 的滤膜过滤，即得。2 3 测定方法：取各供试品溶液2 0uL ，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，即得。其中1 5 峰为该图谱的特征峰，见图1 、图2 。 巫山淫羊藿4 0m nB 茬革藿C 箭叶淫革l图1 巫山淫羊藿的指纹图谱图图2 巫山淫羊藿、淫羊藿、箭叶淫羊藿指纹图谱比对中国药典2 0 0 5 年版科研资助项目国药典发( 2 0 0 3 ) 4 5 号叫11112 3 ( 增刊) ，2 0 0 33 l2 5 对照实验：取柔藿苷、淫羊藿苷对照溶液2 0 0l L ，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图3 。图3 柔藿苷( A ) 和淫羊藿苷( B ) 对照品色谱图3 结果3 1 由图l ，2 ，3 可见三种指纹图谱特征性在于色谱峰相互比例差异较大。巫山淫羊藿、淫羊藿、箭叶淫 羊藿中均有淫羊藿苷( 3 号峰) ，柔藿苷( 5 号峰) 。但后两种中淫羊藿苷含量较高；柔藿苷是巫山淫羊藿中主要色谱峰，在淫羊藿、箭叶淫羊藿为次要峰。3 2 用相似度计算软件分析5 批不同采收期的巫山淫羊藿色谱数据，不同采收期的巫山淫羊藿相似度均高于0 9 9 。3 3 分别取四批巫山淫羊藿、淫羊藿、箭叶淫羊藿供试品按2 1 3 项下操作，所得色谱数据以色谱峰原始信号相匹配，3 号峰( 柔藿苷峰) 、5 号峰( 淫羊藿苷峰) 为M a k e r 标记，用夹角余弦法计算，结果见图4 。不同月份采集巫山淫羊藿之间的相似度较高( 均大于0 9 9 ) 。用夹角余弦法计算所得相似度均值巫山淫羊藿为0 9 9 6 ，淫羊藿0 9 2 6 ，箭叶淫羊藿0 9 5 1 。由柱状图可明显区别开巫山淫羊藿、淫羊藿与箭叶淫羊藿。3 43 号峰为柔藿苷，是巫山淫羊藿中含量较高的黄酮成分，以其作为参照峰。共有峰相对保留时间和相对峰面积见表1 ，表2表l巫山淫羊藿样品共有峰相对保留时间3 2药物分析杂志表2巫山淫羊藿样品共有峰相对峰面积由上表可见，5 批不同采收期的巫山淫羊藿色谱共有峰相对保留时间R S D 1 ，但是5 批间共有峰相对峰面积的R S D 远大于5 。说明共有峰的人工计算方法在处理未基线分离的峰组时存在劣势。原因为未基线分离的色谱峰积分时存在系统误差。3 5 用电信号处理方法为色谱原始信号匹配，算法为相关系数( 包括中位数相关系数法，均值相关系数法) 、夹角余弦法，3 号峰( 柔藿苷峰) 、5 号峰( 淫羊藿苷峰) 为M a k e r 标记，对5 批色谱数据进行分析，结果见表3 。表3相似度软件分析的结果提示该算法结果稳定，适用于本实验数据的分析。4 讨论4 1 对甲醇一水、甲醇一水一醋酸、乙腈一水、乙腈水一醋酸四种体系进行了考察，结果乙腈一水( 2 5 ：7 5 ) 时特征峰分离度较好，峰性对称，选为流动相。 4 2 在乙腈。水( 2 5 ：7 5 ) 流动相条件下，分别选检测波长为2 3 0 n m ，2 5 4 n m ，2 7 0 n m ，2 8 0 n m 对供试品进行测定并比较所记录色谱谱图。结果2 7 0 n m 波长的谱图峰个数多，吸收值较高，特征峰明显，选择检测波长为2 7 0 n m 。致谢：感谢西北大学分析科学研究所李华教授、王康，中南大学梁逸曾教授为我们提供指纹图谱相似度对比软件!