試寫出幾種檢測試寫出幾種檢測 DNA 多態性的基因技術多態性的基因技術 1限制性片段長度多態性（限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：）：由 DNA 的多態性，致使 DNA 分子的限制酶切位 元點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段 的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性，導致限制片段長度發生改變 的酶切位點，又稱為多態性位點。最早是用 Southern Blot/RFLP 方法檢測，後 來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用 PCR- RFLP 法進行研究基因的限制性片段長度多態性。 2單鏈構象多態性（單鏈構象多態性（SSCP）：）：是一種基於單鏈 DNA 構象差別的點突變檢測 方法。相同長度的單鏈 DNA 如果順序不同，甚至單個堿基不同，就會形成不 同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將 PCR 產物經變性後，進行單鏈 DNA 凝膠電泳時，靶 DNA 中若發生單個堿基替換等改變時，就會出現泳動變位 （mobility shift） ，多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。 3PCR-ASO 探針法（探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：）：即等位基因 特異性寡核苷酸探針法。在 PCR 擴增 DNA 片段後，直接與相應的寡核苷酸探 雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用 PCR 擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核 苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變堿基。突變堿 基及對應的正常堿 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件， 使只有與探針序列完全互補的等位元基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央 堿基不同的等位元基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交， 說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子， 若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜 交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻 不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。4. PCR-SSO 法：法：SSO 技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO） 。原理是 PCR 基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸 探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與 PCR 產物在一定條件 下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循堿基互補的原則。探針可用放射性同位素 標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、 過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。5. PCR-SSP 法：法：序列特異性引物分析即根據各等位元基因的核苷酸序列，設計 出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific） 、或組特異性 (group- specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP） 。SSP 只能與某一等位基因特異 性片段的堿基序列互補性結合，通過 PCR 特異性地擴增該基因片段，從而達到 分析基因多態性的目的。6. PCR-螢光法：螢光法：用螢光標記 PCR 引物的 5端，螢光染料 FAM 和 JOE 呈綠色 螢光，TAMRA 呈紅色螢光，COUM 呈蘭色螢光，不同螢光標記的多種引物同時參加反應，PCR 擴增待檢測的 DNA，合成的產物分別帶有引物 5端的染料， 很容易發現目的基因存在與否。 7. PCR-DNA 測序：測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於 PCR 技術的應用， 使得 DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入 PCR 直接測序。PCR 產物在 自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger 雙去氧末端終止法;Maxam- Gilbert 化學裂解法；DNA 測序的自動化。目前 DNA 順序全自動鐳射測定法是 最先進的方法。 8. PCR 指紋圖法（指紋圖法（PCR-fingerprints）：）：實用於快速的同種異型 DR/Dw 配型。 在 DR/DW 純合子及雜合子個體中，每種 DR 單倍型及每種單倍型組合所產生 的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分 子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同， 從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即 PCR 指紋。也有人用人工合成的短寡核苷 酸片段作為探針，同經過酶切的人體 DNA 作 Southern blot，可以得出長度不等 的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾 乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為 基因指紋(gene finger-printing)。 9. 基因晶片法：基因晶片法：又稱為 DNA 微探針陣列（Micro array） 。它是集成了大量的密 集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與 晶片特定位元點上的探針雜交，利用基因晶片雜交圖像，確定雜交探針的位置， 便可根據堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性 的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶片採用多色螢光探針雜交技術可以大大 提高晶片的準確性、定量及檢測範圍。應用高密度基因晶片檢測單堿基多態性， 為分析 SNPs 提供了便捷的方法。 10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法）法AFLP 技術是一項新的分子標記技術，是基於 PCR 技術擴增基因組 DNA 限制 性片段，基因組 DNA 先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈結頭連接到 DNA 片 段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片 段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了 RFLP 和 PCR 技術特點，具有 RFLP 技術的可靠性和 PCR 技術的高效性。由於 AFLP 擴增可使某一品種出現特定的 DNA 譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶 產生，因此，這種通過引物誘導及 DNA 擴增後得到的 DNA 多態性可做為一種 分子標記。AFLP 可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說 AFLP 技術是 一種新的而且有很大功能的 DNA 指紋技術。11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法）法 變性梯度凝膠電泳法（） DGGE 法分析 PCR 產物，如果突變發生在最先解鏈 的 DNA 區域，檢出率可達 100，檢測片段可達 1kb，最適圍為 100bp- 500bp。基本原理基於當雙鏈 DNA 在變性梯度凝膠中進行到與 DNA 變性濕度 一致的凝膠位置時，DNA 發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的 DNA 鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度 而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電 泳裝置，合成的 PCR 引物最好在 5末端加一段 40bp-50bp 的 GC 夾，以利於檢 測發生於高熔點區的突變。在 DGGE 的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學 變性劑的 TGGE 法（溫度梯度凝膠電泳 temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE） 。DGGE 和 TGGE 均有商品化的電泳裝置，該法一經 建立，操作也較簡便，適合於大樣本的檢測篩選。 12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法）法 運用隨機引物擴增尋找多態性 DNA 片段可作為分子標記。這種方法即為 RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性 DNA)。儘管 RAPD 技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測 DNA 多態性的方式以及快速、 簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該 RAPD 技術建立於 PCR 技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚 核苷酸單鏈(通常為 10 聚體)為引物,對所研究基因組 DNA 進行 PCR 擴增.聚丙 烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經 EB 染色或放射性自顯影來檢測擴增產物 DNA 片 段的多態性,這些擴增產物 DNA 片段的多態性反映了基因組相應區域的 DNA 多 態性。RAPD 所用的一系列引物 DNA 序列各不相同,但對於任一特異的引物,它 同基因組 DNA 序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位元點在基因組某些 區域內的分佈如符合 PCR 擴增反應的條件,即引物在範本的兩條鏈上有互補位 置,且引物 3端相距在一定的長度範圍之內,就可擴增出 DNA 片段.因此如果基因 組在這些區域發生 DNA 片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合 位點分佈發生相應的變化,而使 PCR 產物增加、缺少或發生分子量的改變。通 過對 PCR 產物檢測即可檢出基因組 DNA 的多態性。分析時可用的引物數很大, 雖然對每一個引物而言其檢測基因組 DNA 多態性的區域是有限的,但是利用一 系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此 RAPD 可以對整個基因 組 DNA 進行多態性檢測。另外，RAPD 片段克隆後可作為 RFLP 的分子標記進 行作圖分析。舉例論述舉例論述 DNA 多態性在醫學中的應用價值多態性在醫學中的應用價值 採用酶聯免疫方法測定妊娠 14 2 0w 孕婦血清甲胎蛋白 (AFP)和絨毛膜促性 腺激素 亞基 (HCG)濃度 ,結合孕婦年齡、孕周和體重 ,用電腦軟體進行分 析 ,得到每位孕婦所懷胎兒 DS 風險係數。對篩查出胎兒唐氏綜合征高風險孕婦 ,再 利用 2 1 號染色體上的 6 個多態性位點對其作產前基因診斷。產前篩查結合基因多態性在唐氏綜合征產前診斷中具有很好的應用價值中國優生與遺傳雜志2003, 11(1) 一就診者從症狀和體征上疑似鐮刀形細胞貧血，若採用基因診斷方法進行確診，一就診者從症狀和體征上疑似鐮刀形細胞貧血，若採用基因診斷方法進行確診， 請問你從何著手，寫出方案。請問你從何著手，寫出方案。 鐮刀細胞性貧血的分子基礎是什麼鐮刀細胞性貧血的分子基礎是什麼?是一種常染色體隱性等位基因出現突變的遺傳病。發生的根本原因是血紅蛋白 的一級結構發生了差錯。人血紅蛋白 亞基的第 6 位氨基酸應該是谷氨酸，而 在鐮刀型貧血的血紅蛋白中卻是纈氨酸，本是水溶性的血紅蛋白，就會聚集成 絲，相互粘著，導致紅細胞變形成鐮刀狀而極易破裂，產生貧血。 鐮刀形細胞貧血的基因診斷方法有哪些？鐮刀形細胞貧血的基因診斷方法有哪些？ 1. PCR 擴增後直接測序 2. 限制性內切酶消化 3. 特異性寡核苷酸探針雜交 4.變性高效液相色譜法 實驗室檢查：網織紅細胞計數器實驗室檢查：網織紅細胞計數器 1.外周血血紅蛋白為 50100g/L，危象時進一步降低。網織紅細胞計數常在 10%以 上。紅細胞大小不均，多染性、嗜鹼性點彩細胞增多可見有核紅細胞、靶形紅 細胞異形紅細胞、Howell-Jolly 小體。鐮狀紅細胞並不多見，若發現則有助於診 斷通常採用“鐮變試驗”檢查有無鐮狀細胞。紅細胞滲透脆性顯著降低白細胞 和血小板計數一般正常。 2.骨髓象示紅系顯著增生，但在再生障礙危象時增生低下，在巨幼細胞危象時 有巨幼細胞變 3.血清膽紅素輕中度增高，溶血危象時顯著增高。本病的溶血雖以血管外溶 血為主，但也存在著血管內溶血。 4.血漿結合珠蛋白降低，血漿遊離血紅蛋白可能增高。 5.紅細胞半衰期測定顯示紅細胞生存時間明顯縮短至 515 天正常為(285)天 6.血紅蛋白電泳顯示 HbS 占 80%以上 HbF 增多至 2%15%，HbA2 正常，而