中医杂志2 0 0 6 年6 月第4 7 卷增刊实验研究环维黄杨星干预高血压大鼠脑缺血神经肽与超微结构的研究谭峰，顾卫，万赛英吴海科1郅敏1王金良1黄涛1黄彪1孙景波2本实验采用环形银夹使S D 大鼠的双侧肾动脉狭窄，制成易卒中型肾血管性高血压大鼠( R H R S P ) ，再用线栓法制成一侧大脑中脉闭塞( M C A 0 ) 脑缺血一再灌注模型，采用放射免疫法、干湿称重法、显微镜一微机图像分析与Z e aL o n g a5 分制标准评分法和透射电镜等技术对大鼠脑缺血6 小时后复流6 、7 2 、1 6 8 小时大鼠脑组织神经肽( N P Y ) 表达、水含量、梗死面积百分率、行为学评分及细胞超微结构的动态变化进行了研究，观察环维黄杨星( C V B ) ( 治疗组) 对上述指标的干预作用，并与生理盐水组( x t 照组) 及假手术组对照，为C V B 的临床应用提供新的实验依据，现报告如下。 1 材料和方法1 1实验药品：C V B 粉剂由南京小营药制药厂生产提供，临用前先以9 5 酒精、冰醋酸溶解，然后用生理盐水配成2 m g m l 备用。1 2 动物选择：月龄为2 “ 3 个月，体重为9 0 - - 一1 2 0 9的清洁级S D 雄性大鼠5 0 只，由广州中医药大学动物中心提供。 2 实验方法2 1R H R S P 的制备：7 4 只大鼠按文献报道的方法行双肾动脉狭窄术 1 ，整个过程注意不要损伤肾脏、肝脏、乳糜池及肾静脉。逐层关腹，术后腹腔下注射少量庆大霉素防感染。术后1 0 周备用。另外6 只大鼠不作任何处理，只作正常血压值测定。2 2M C A O 实验的制备：动物选择：( 1 ) 双肾动脉狭窄术后1 0 周；( 2 ) 血压超过2 4 k P a 或以上；( 3 ) 从未出现脑卒中的症状和体征。M C A 0 模型的复制参照Z e aL o n g a 2 方法加以改进：选用R H R S P 大鼠，1 0 水合氯醛( 2 5 3 m l k g ) 腹腔麻醉后，颈正中切I ：1 ，逐层分 离皮下组织和肌肉组织，暴露分离左侧颈总动脉( C C A ) 、颈外动脉( E C A ) 、颈内动脉( I C A ) ，结扎并游离E C A 及其分支，沿I C A 向下分离翼腭动脉( P P A ) 。于E C A 残端起始部剪一小口，由此口轻轻插人制备好的尼龙线，快到P P A 时，用镊子轻轻挟住P P A 起始部，让尼龙线顺利进入I C A 颅内段，尼龙线插入深度1 0 3 以C E A 分叉处开始计算约( 1 8 0 5 ) c m 。术毕，缝合皮肤。复流时外拉尼龙线使其球端回到E C A 内，即可恢复颈内动脉和大脑中动脉( M C A ) 供血。术后单笼喂养观察。2 3 行为学评分：参考Z e aL o n g a5 分制评分标准评分利：0 分，无神经损伤症状；1 分，不能伸展对侧前爪；2 分，向外侧划圈；3 分，向对侧倾倒；4 分，不能自发行走，意识丧失。实验成功的标志为线栓鼠即出现左侧H o m e r 综合征( 左侧瞳孔缩小) ，麻醉清醒时出现右前肢或前后肢瘫痪，规定缺血时限内( 术后2 “ - - 3 小时) 未出现右侧肢体瘫痪或已死亡的大鼠被剔除。复流成功以线栓拔出后l C A 、W i l U s 环无血栓及出血为标准。2 4 动物分组：将用于复制可再灌流M C A O 模型的 7 4 只R H R S P 大鼠用随机数字表法分为高血压空白组( 9 只) 、假手术组( 9 只) 和实验组( 5 6 只) ，实验组复制成可再灌流的M C A 0 模型，根据缺血6 小时后复流6 、7 2 、1 6 8 小时不同时间再随机各分为C V B 治疗I 组( 1 0 只) 、治疗组( 9 只) 、治疗组( 8 只) 和生理盐水对照I 组( 1 0 只) 、对照组( 8 只) 、对照噩组( 8 只) 3。 组。2 5 动物处理：正常组不作任何处理同时期饲养；假手术组分离右侧C C A 、C E A 、I C A ，不结扎动脉，即缝合切口后单笼饲养；治疗I 组在缺血6 小时后再灌注开始即腹腔注射C V B 6 4 8 m g k g 加生理盐水1 5 m l ；治疗组：经治疗I 组治疗后，每7 小时重复1 次( 用药方法同上) ，每天给药2 次；治疗砸组：同治疗组。生理盐水对照I 组、组、噩组：分别腹腔注射生理盐水2 m l 次，用法同治疗组。正常组、假手术组同时期分别观察7 天后在腹腔麻醉下处死，其余各实验组分别在再灌注后6 、7 2 、1 6 8 小时末次给药3 0 分钟后在腹腔麻醉下处死。每组随机取3 只鼠脑经灌流固定后切片制作光镜、电镜样本，其余在腹腔麻醉下断头取脑检测脑匀浆N Y P 含量。2 6 大鼠脑N P Y 含量的测定：相应时间点过量麻醉药处死大鼠，于冰盘上快速拔出完整的大脑组织，分成两个半球，把右侧半球从额极后移3 m m 冠状切开，取一3 5 m m 厚切片，皮质同一位置取脑片，称重后在生理盐水中煮沸5 分钟，以灭活蛋白酶，置玻璃匀浆器内加入l m o l LH A C l m l ，充分匀浆后低温离心1 5 分钟( 3 5 0 0 转分钟) ，取上清液，加抑肽酶一2 0 保存待测，测定前用N a O H 中和。采用放射免疫法检测N P Y免疫活性，操作按说明书以顺序饱和加样的顺序进行。 根据标准曲线上N P Y 免疫活性物质的量，再换算成每克湿重脑组织N P Y 免疫活性物质的含量，单位为n g g 脑重。按文献嘲方法测定脑组织含水量：脑含水量一( 脑湿重一脑干重) 脑湿重1 0 0 。2 7 光镜、电镜标本制作：每组随机取3 只大鼠在设定再灌流时间结束时过量麻醉药处死后，经升主动脉灌注4 多聚甲醛( o 0 1 m o l L 、P B Sp H 7 4 ) 3 0 分钟后断头取脑，从额极向后移3 m m 起，取3 5 m m 厚冠状切面，进一步固定后梯度脱水、石蜡包埋，由额叶向后每间隔0 5 m m 连续作5 个冠状切片，切成2 肛m 厚薄片，H E 染色，用于光镜下测定梗死面积百分比。另外在大脑中动脉供血区的顶叶皮质取样3 4 小块，立即固定于常规电镜液中，1 饿酸固定2 小时，0 1 MP B S( p H 7 4 ) 冲洗( 1 5 3 ) ，常规酒精梯度脱水，环氧树脂E P O N 一8 1 2 常规电镜包埋，超薄切片，醋酸双氧铀一柠檬酸铅双染色。J E M1 2 0 0 - - E X H 6 0 0 透射电镜观察超薄片、摄像。2 8 统计学处理：采用S P S Si i 0 统计软件包对数据进行处理。所有计量资料数据用平均数标准差表示，多个实验组间比较用方差分析，两个实验组问比较用t检验，计数资料组间比较用秩和检验。3结果3 1C V B 对R H R S P M C A O 大鼠脑组织N P Y 、水含量、梗死面积百分率与行为学评分的影响：实验I组M C A O 大鼠脑缺血一复流6 小时后脑组织N P Y 、含水量与高血压空白组、假手术对照组相比，均明显升高( P ；缺血复流7 2 小时后，实验组大鼠N P Y 、含水量、脑梗死面积百分率则明显高于实验I组( P 0 0 5 ) ，但脑组织N P Y 水平仍高于实验I 组( 尸 0 0 5 ) 。3 2C V B 对R H R S P M C A O 大鼠脑组织细胞超微结构改变的影响：电镜显示正常组与对照组脑缺血一复流上述不同时间大鼠脑组织细胞核膜双层结构清J T C M J u n e2 0 0 6 ，V 0 1 4 7 ，S u p p l e m e n t晰，染色质分布正常，胶质细胞双层核膜结构完整，细胞器结构正常，可见线粒体和粗面、内质网等；髓鞘结构完好，髓鞘内微丝、微管结构正常；血管壁连续，可见基膜，内皮细胞胞质丰富。实验组脑缺血一复流6 小时即出现神经元和血管壁的损害，复流7 2 小时时细胞核膜消失，染色质轻度溶解；胞膜消失，胞质水肿，大部分细胞器溶解消失，细胞呈坏死结构；复流1 6 8 小时时胶质细胞核周间隙扩大，染色质溶解，部分线粒体空泡化，粗面内质网肿胀，髓鞘板层分离、层间模糊不清，有些部位出现断裂、溶解等；血管壁连续，内有运输小泡，可见基膜，管腔狭窄。 4 讨论本实验显示，脑缺血一复流6 、7 2 小时时脑组织N P Y 水平逐渐上升，脑梗死面积百分率也逐渐增大；脑缺血一复流1 6 8 小时时脑组织N P Y 水平下降，脑梗死面积百分率也减低。说明N P Y 与脑梗死的病程演变密切相关，提示对A C I 急性期进行N P Y 动态监测，不仅可了解A C I 不同时间内脑血管的舒缩功能及血小板的聚集状态，而且尚可对脑梗死程度的判定及指导治疗提供参考数据。因此，监测A C I 不同时间内N P Y 水平的动态变化对于缺血性脑损伤的病情分析有着非常积极的意义。本实验采用环银夹狭窄大鼠双侧肾动脉，复制形成一种R H R S P ，再用颈内动脉插线法模拟出人类具有高血压性脑血管损害病变基础的局灶性脑梗塞模型。超微结构的观察显示实验组脑缺血一复流6 小时即出现神经元和血管壁的损害，随着缺血一复流时间的延长，细胞超微结构的损害加重，复流7 2 小时时细胞核膜消失，染色质轻度溶解；胞膜消失，胞质水肿，大部分细胞器溶解消失，细胞呈坏死结构；复流1 6 8 小时时胶质细胞核周间隙扩大，染色质溶解，部分线粒体空泡化，粗面内质网肿胀，髓鞘板层分离、层间模糊不清，有些部位出现断裂、溶解等；血管壁内有运输小泡，管腔 狭窄。表明N P Y 动态变化的规律与A C I 的病理演变基本相符，提示N P Y 参与了脑缺血复流中枢神经损伤的发生、发展的病理过程，是引起血脑屏障受损和神经功能缺失的重要原因之一。因此，选择特异性的N P Y 受体拮抗剂有可能为脑卒中的治疗带来新的途径。本实验发现C V B 治疗组，缺血区脑组织含水量显著减少，局灶性脑梗死面积百分率缩小，与国内的报道一致艮 ，提示C V B 能降低大鼠缺血再灌注引起的脑水肿，改善和恢复缺血损伤脑组织的血液供应，减轻由此引发的一系列代谢产物的损害及脑梗死面积，对缺血中医杂志2 0 0 6 年6 月第! ! 鲞遭型再灌注引起的损伤具有较好的保护作用。机制可能与提高N a + 一K + 离子交换泵的活性及提高大脑侧支血管代偿能力，改善缺血区脑细胞的供血、供氧、供能状况有关。因此C V B 对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能是针对其复杂的病理生理机制，具有多环节、多靶点的独特作用，但具体的机制有待进一步的研究。参考文献IZ e n gJ ，Z h a n gY ，M oJ ，e ta 1 T w o - - k i d n e y ，t w oc l i pR e n o v a s c u l a rh y p e r t e n s i v er a t sc a nb eu s e da ss t r o k e p r o n eR a t s S t r o k e 19 9 8 ，2 9( R ) 】7 0 8 】7 】3 2Z e aL o n g a E v e r s i b l em i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o nw i t b o u tc r a n i e c -t o m yi nr a t s S t r o k e ，1 9 8 9 1 9 ( 3 ) ：i 0 9 1 1 4 3 谭峰，贺石林，李安国，等急性脑水肿模型的建立及不同时相变化的研究，中国危重病急救医学，1 9 9 4 ，6 ( 3 ) ：1 3 6 1 3 9 4陶欣艺，沈祥春，方泰惠环维黄杨星D 对实验性脑缺血的保护