仲景合法方对B C G L P S 所致小鼠免疫性肝损伤 免疫功能的影响王培利李宇航顾立刚李澎涛 ( 北京中医药大学伤寒教研室，1 0 0 0 2 9 )病毒性肝炎是现在已经成为严重影响我们人民健康的重大疾病。现代研究表明，免疫损害 机制在病毒性肝炎发病和慢性化过程中起到主要作用。张仲景伤寒论和金匮耍略中的 小柴胡汤、茵陈蒿汤、大黄蛾虫丸、黄苠建中汤四方，是一系列临床疗效奇佳的经方，它们广 泛用于治疗各种肝胆系统疾病。本研究从这四方和、清、消、补的治法出发，配合仲景肝病传 脾的见解，各取小柴胡汤、茵陈蒿汤、大黄蝰虫丸、黄芪建中汤中主要药物，组成一首融仲景四法于一方的合法方剂，探讨其对免疫性肝损伤小鼠免疫功能的影响。 1 材料与方法 1 1 实验动物昆明雄性小鼠体重1 8 士0 5 9 购自中国医学科学院实验动物研究所。 1 2 药物与试剂1 2 1 中药水煎剂制备：中药购自北京中医药大学国医堂。由北京中医药大学实验中医教研室提供。 1 2 2 联苯双脂，北京协和药厂。卡介蓖( B C G ) 由卫生部北京生物制品所提供。小鼠血 清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。细菌脂多糖( L P S ) ：S i g m a 公司出品。“ l Y i s - N H 4 C I 溶液。R P M I - 1 6 4 0 培养液。刀豆蛋白 A ( C o n A ) ，S i g m a 公司出品。P B S 缓冲液，购自北京鼎国生物制品公司。 1 3 主要器材低温离心机，S C R 2 0 B A 型，日本产。倒置显微镜：O l y m p u s ，I M T - 2 型， 日本产。C 0 2 恒温培养箱：R K l l 0 0 0 1 B 型，日本产。单道加样器；2 0 pI 2 0 0 uI ，1 0 0 0 uI ，F i n n p i p e t t e 牌，芬兰产。2 4 孔、9 6 孔平底细胞培养板，C o s t a r 美国产。 1 4 动物分组：昆明雄性小鼠随机分成6 组。每组1 0 只。每只小鼠尾静脉注射B C G lm g ， 1 2 d 后再尾静脉注射L P S l 0pg 以制造免疫性肝损伤模型I l “l 。制造模型同时给药。分别为正常 对照组，B C G + L P S 模型组。联苯双酯阳性药对照组，中药大剂量+ B C G L P S 组，中药中剂量+ B C G ，l L P S 组，中药小剂量+ B C G L P S 组：后三组分别灌胃中药0 2 9 l O g 、0 1 1 0 9 和O 0 5 9 1 0 9 0 2 m l 只共1 2 d ，联苯双酯阳性药对照组灌胃联苯双酯1 5 0 m g k g o 2 m l 只灌胃，正常组和模型组分别用蒸馏水灌胃0 2 m l 只 1 5 取材方法：以上各组小鼠尾静脉注射L I P S 后2 4 小时后脱颈处死，无菌抽取腹腔液及摘 取脾脏。测定臣噬细胞吞噬能力、N O 生成能力和T 、B 细胞转化率；然后摘取胸腺，称重计算 胸腺指数( 胸腺指数= 腮腺重量，体重) 。 1 6 脾T 、B 淋巴细胞增殖能力的测定：采用M T T 比色法”J 。 无菌摘取脾脏，研磨，过2 0 0 目细胞筛，1 5 0 0 转，分离心1 0 分钟，加入T r i s - N H 4 C I 溶液 破坏红细胞。用不舍小牛血清的R P M I1 6 4 0 培养基洗细胞二次，用含1 0 小牛血清的R P M I 1 6 4 0 培养基重悬细胞，显微镜下计数，调细胞浓度至5 1 0 6 m l 。加入9 6 孔细胞培养板1 0 0u l ，孔，再分别加入C o n A l 0 0 u l ，孔使其终浓度为6 ug m l ，测T 淋巴细胞转化率，加入L P S l 0 0ul ，孔使其终浓度为1 0 g m l 测B 淋巴细胞转化率。将上述加好的板置3 7 “ C 、5 C 0 2 培养箱6 8 小时，取出，每孔吸出8 0 u l ，再加入0 S m g l m l M T T l o uu 孔，置培养箱内4 小时，取出，加1 0 S D S H C I 溶液1 0 0uu 孔，震荡过夜，酶标仪测5 7 0 n m 波长的吸光度C A ) 值。以各样 本A 值代表其T 、B 淋巴细胞增殖能力。 1 7 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定：采用绵羊红细胞吞噬法2 1 6处死上述小鼠后给每只小鼠腹腔注入腹腔冲洗液8 m l ，揉腹l m i n ；无菌取腹腔液约5 m l 只，用H a n k s 液洗细胞2 次，O 2 0 o 台盼兰活细胞计数 9 5 ；以含1 0 N C S 的R P M l l 6 4 0 完 全培养液调整细胞浓度为4 1 0 6 m l ：加入2 4 孔细胞培养板内，l m F 孔。每个样品设2 个复孔， 将2 4 孔板置3 7 “ C 5 C 0 2 恒温培养箱内孵育4 h 后取出，弃去未粘附细胞，阻预温的H a n k s 液 洗板3 次；加入5 绵羊红细胞1 m 吼，继续孵育2 0 m i n 后，H a n k s 液洗板3 次；加入M 中溶解液0 5 m l 孔细胞溶解后分装9 6 孔板内，每孔o 1 m l ；酶标仪比色测定波长为5 3 0 n m 1 8N O 诱生量的测定用亚硝酸盐测定法“1 N O 的生成以测定培养上清中N 0 2 - 的含量为指标，后者为N O 的氧化物。上述各组小鼠腹 腔M 巾用H a n k s 液洗细胞2 次，o 2 台盼兰活细胞计数 9 5 ，用含1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 0 完全培养液调细胞浓度为4 1 0 6 m l 。加入9 6 孔细胞培养板内。1 0 0uI ，孔，每个样品设3 个复 孔。置3 7 “ 1 2 5 C 0 2 培养箱培养4 h 后取出，以预温的H a n k s 液洗板3 次，弃去未粘附细胞。加 入含1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 0 完全培养液0 1 m l 孔。置3 7 “ ( 2 S C 0 2 培养箱培养1 2 小时，然后每孔取上清5 0 8 1 至另一培养板，加G r i e s s 试剂( 1 对氨基苯磺酸、O I N 1 萘乙二胺盐 酸盐、2 5 H 3 P 0 4 ) 5 0 t t i ，室温1 0m i n ，在波长5 4 0n m 测定吸收度A 。以亚硝酸钠同样操作 作出标准曲线，求出N 0 2 - 的含量。 1 9 统计学方法：实验数据用x s 表示，组问比较采用S P S S l 0 0 软件进行方差分析和t检验。 2 结果 2 1 仲景合法方对胸腺指数、脾T 、B 淋巴细胞增殖能力的影响 实验结果发现，B C G L P S 所致小鼠肝损伤模型组T 、B 淋巴细胞增殖能力和与正常对照组比较，下降明显( P 如0 1 ) ：联苯双酯阳性药对照组与模型组比较，有明显促进作用口t 0 0 5 ) 7 仲 最合法方组方大、小剂量组分剐与模型组比较，增殖能力显著增强( P 如o a ) ，中剂量则差异极显著，效果比联苯双酯阳性药对照组好：表I 仲景台法方组方对B C G L P S 免疫性肝损伤小鼠淋巴转化率的影响说明，t 抖_ 模型组与正常对照组比较，P 0 O l ；用药组与模型组比较- P 0 - 0 5 , P 0 0 l 2 2 仲景合法方对免疫性肝损伤小鼠巨噬细胞吞噬能力、N O 生成能力的影响实验结果显示，模型组巨噬细胞吞噬能力比正常组显著降低( P 0 0 1 ) ，各治疗组巨噬细胞吞噬能力较模型组有不同程度的升高( P 0 0 5 ，P 0 0 1 ) ，其中中药大剂量组差异极显著，而且较正常组也有升高作用( P 0 0 5 ) 。模塑组N O 生成能力比正常组显著降低( P 0 0 1 ) ，其他各 治疗组均能显著升高N O 生成能力( P 0 0 1 ) ，以中药中剂量组效果略好，但与其他治疗各组无差异。表2 各组小鼠巨啦细胞吞噬能力比较分组动物致巨瞧细胞吞噬能力N O 生成能力对照组1 00 0 4 6 0 + 0 0 0 4 40 8 1 6 + 0 - 0 4 3模型组1 0O 0 2 1 0 4 “ 0 0 0 5 6 “0 3 3 14 “ 0 0 1 6 ”联苯取硝组1 0O 0 2 7 5 + 0 0 0 5 3 0 6 3 6 4 “ 0 0 4 8 “2 1 7一。_ - - 。- _ - _ _ - 。_ _ _ - _ _ - _ - _ _ - _ _ - _ _ - - _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ 一大剂量组1 00 0 3 6 4 “ 1 - 0 0 0 7 8 * 0 , 6 8 9 + 0 0 1 7 “ *中剂量组1 0 0 0 5 0 7 “ l 9 0 0 1 1 1 * 0 7 3 8 士0 0 1 6 * 小剂量组1 00 0 3 3 7 0 0 0 8 8 *O 6 1 8 “ + 0 0 9 3 * *说明：岸_ 模型组与正常对照组比较，P 0 0 1 ；用药组与模型组比较P O 0 5 。D 0 们2 3 仲景和清消补法对小鼠脾细胞产生细胞因子T h f ( W N Y ) 和T h 2 ( I L - 4 ) 平衡的影 响( 表4 )与模型组比较仲景和清消补法组方大、中剂量组均可明显降低小鼠脾细胞产生I n nY 的 能力( P 如0 1 ) ，而小剂量和联苯双酯组也能降低小鼠脾细胞产生I F N - Y 的能力，但较大、中 剂量稍差：与正常对照组比较，无明显差异。但仍有降低趋势。模型缎与正常对照组比较血清I L 广4 含量有极显著升高( P 0 0 1 ) ：伸景和清消补法组方 大、中小剂量组与模型组比较，血清I L 4 含量均有极显著升高( P 锄0 1 ) ：联苯双酗组与模型 组也有显著差异( P o 0 5 ) ：备治疗组与正常组无明显差异，但均有降低趋势表3 各组小鼠脾细胞产生I F N Y 和1 1 - 4 能力比较s )注：荐薛模型组与正常对照组比较，P O 们I 用药组与模型组比较，P 0 0 5 ，p 0 0 1 说明tl 、2 、3 、4 、_ 5 、6 分别表示正常对丽组、模型组、联苯双酿组、中药大剂量组，中药中剂量组、中药小剂量组3 讨论 仲景和清消补法是针对临床上慢性肝炎湿热挟毒血脉瘀阻，络脉涩滞。肝郁脾虚道的病因病机特点遵循伸景辨证论治思路，取和、清、消、补四法，有机组合而成的治疗方法。 现代医学认为肝炎是由于肝炎病毒或感染病毒的肝细胞和宿主免疫系统之间相互作用t 引 起的慢性肝损伤。慢性肝炎治疗中要面临的主要问题是如何阻断病毒感染后的慢性化慢性化 的主要机制是宿主对HBV 的各种抗原的完全或不完全的免疫耐受，形成免疫耐受主要是由于宿主免疫功能低下或自身变异而形成了免疫逃避I ”。D u d l e y 提出细胞免疫缺陷或功能不全是引2 1 8起慢性肝炎的主要原因1 4 l 。有研究表明H B V 持续感染复制，引起肝细胞损害，是慢性肝病活动 的直接原因l s I 。卡介苗( B C G ) 和脂多糖( L P S ) 尾静脉联合注射制造免疫性肝损伤模型，是探讨慢性肝 炎免疫机制理想的模型，近些年已被广泛采用。 T 、B 淋巴细胞由前T 、B 淋巴细胞发育成熟以及分化释放都是按照正