碳青霉烯酶研究进展俞云松浙江大学医学院附属第一医院碳青霉烯类抗生素对人多数B 一内酰胺酶包括超广谱0 一内酰胺酶( E S B L s ) 和A m p C 酶都很稳定，与青霉素结合蛋白( P B P s ) 亲和力强，并能够有效渗透细菌外膜进入周质间隙，具有抗菌谱广、杀菌活性强大的特点，被认为是目前临床上控制革兰阴性菌感染虽有效的抗生素，同时也是治疗重症及免疫缺陷患者感染 的重要药物。随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。其耐药机制主要 有：( 1 ) 碳青霉烯酶的产生( 2 ) 高产A m p C 酶伴外膜孔蛋白的丢失( 3 ) 靶位的改变( 4 ) 主动泵出系统的 过度表达。特别是，近年来产生获得性碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌科细菌的报道有所增加。南这些产酶菌株引起的院内感染爆发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地。碳青霉烯酶是指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的类1 3 内酰胺酶，分别属 于A m b l e r 分子分类中的A 类、B 类、D 类酶。其中B 类为金属酶，在B u s h 分群中为第三组。可由染色体、质粒或转座子介导，由后者编码的获得性金属酶可见于铜绿假单胞菌、不动杆菌、肠杆菌科细菌；h 类、D 类为丝氨酸酶，属于B u s h 分群中的2 f 和2 d 皿组，A 类酶见于些肠杆菌科细菌，D 类酶主要见于不动杆菌。1 B 类金属酶1TB 类金属酶的特点和分类 第一个以金属离子为活性中心的酶是因蜡样芽胞杆菌产生能被E D T A 抑制的8 一内酰胺酶两发现。之后 世界各地相继报道了能产生这类酶的各种细菌。1 9 8 9 年B u s h 首次将该类酶归为金属一0 一内酰胺酶( m e t a l l o B l a c t a m a s e ) ，简称金属酶“。金属酶不仅对B 一内酰胺酶的抑制剂敏感性差，而且能够水解包括碳青霉烯类抗生素( C a r b a p e n e m s ) 在内的几乎所有B 一内酰胺类抗生素。根据B u s h J a c o b yM e d e i r o s 分类法和A m h l e r 分子分类法，金属酶分别属于m 类和B 类酶。按水解底物的不同，金属酶分为3 组功能砸群3 a 、3 b 、3 c “。3 a 组金属酶作用底物最广，包括青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类，但氨曲南例外，对头孢菌素类的水解速度通常比碳青霉烯类慢。该亚群包括脆弱拟杆菌产生的C c r A 、铜绿假单施菌和粘质沙雷氏菌产生的I M P 类、嗜麦芽窄食单胞菌产生的L 1 以及蜡样芽胞杆菌I I 酶。这些酶除了活性部位的z n ”，还需额外的z n ”才被激活或达到最大的水解活性。3 b 组金属酶主要包括来自气单脆菌属的金属酶C o h h C p h A 2 、A c P 、I m i S 、A s b M l 、A s A l 、A 2 h 以及洋葱伯克霍尔德菌、芳香黄杆菌的金属酶，特别易于水解碳青烯霉类，但并不导致青霉素、头孢菌素耐药，属于真正意义上的碳青霉烯类酶。多数金属酶被E D T A 抑制后加入z n ”能恢复活性，但至少有3 种来自3 b组的酶A C P 、A s b M l 、A S A 一1 的活性能被低浓度的Z n ”( 1 5 u M ) 抑制。3 c 亚群目前只包括来自军团菌的金属酶，主要水解头孢菌素类和碳青霉烯类。多数金属酶对胺培南的水解能力强于美洛培南，但也有例外，蜡样芽胞杆菌I I 酶和3 b 中的A s b M l对美洛培南的水解能力更强。金属酶对氨曲南的水解能力都很弱。根据氨基酸的同源性，B u s h 又把金属酶分成三组结构难型B l 、B 2 、B 3 “1 ( 表1 ) 。B l 亚型包括了绝大多数己知的金属酶，蜡样芽胞杆菌产生的I I 酶( B c I I ) ，脆弱拟杆菌产生的C e r A ( 又拶广州自舌山$ 茹艘份有限笛司2 0 0 5 年抗茵药物研究与临床应用进展学术研讨会名C f i A ) ，脑膜炎败血陆黄杆菌产生的酶B l a b ，n 哚黄杆菌产生的I N D 一1 ，在铜绿假单胞苗、粘质沙雷菌、 肺炎克宙伯菌、鲍曼不动杆菌中发现的I M P 类以及V I M 类都属丁该弧型。酶分子量在2 8 K D 左右，其氨基酸同源性2 3 ，有三个组氨酸和一个、r 胱氨酸残基参与活性部位Z n ”和或水分子的结合。B 2 亚型包括气单胞菌产生的酶C p h A C p h A 2 、I m i S 和S e r r a t i af o n t i c o l 产生的S f h l 。只有一个z n 2 + 活性位点以碳青霉烯类作为底物。B 3 亚型包括嗜麦芽寡养单胞菌的L 1 酶，与其它金属酶氨基酸同源性很低，分子量也要大45 K d a ，是一种四聚体。来自不同菌株的L l 等电点p I 不同，表明L 1 可能是一人家族。军团菌的F E Z l 酶是该亚型的新成员，与L l 有2 9 7 的氨基酸同源性，结合2 n “的残基也相同( H i s 8 4 ，H i s 8 6 ，A s p 8 8 ，H is 8 9 ，H i s l 6 0 ，H i s 2 2 5 ) 。在脆弱拟杆菌中还发现了沉默型金属酶基因，在正常情况下不表达或低水平表达，对亚胺培南敏感， 可冈暴露于碳青霉烯类抗生素，操纵子基因发生突变或在操纵子s O 序列上游插入插入序列( i n s e r t i o ns e q u e n c e ，I S ) 而使金属酶高水平表达”1 。I s 提供持续高水平转录所需的转录起始信号。已发现的I s 有I S 9 4 2 ，I S l l 8 6 ，I S 4 3 5 1 ，前两者能显著提高金属酶的表达，后者中度提高表达水平。8 0 的产金属酶脆弱拟杆菌都存在其中一种I s ，而非产酶株中则很少见。金属酶还可分为天然来源的金属酶和获得性金属酶，前者在碳青霉烯类抗生素商品化应用于临床前就已存在，如在蜡样芽胞杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、黄杆菌属、嗜水气单胞菌、军团菌等细菌中存在的通常 为天然来源的金属酶”1 ，由染色体基因编码，脑膜炎败珈性黄杆菌中还可存在两种不同的天然金属酶。 嗜麦芽窄食单胞菌中存在的L l 金属酶也可由2 0 0 k b 的质粒介导”1 。获得性金属酶主要指I M P 和V I M 类金属酶，基因通常位于I 类整合子中。所谓整合子，是指外来的D N A 能够以基因盒的形式在此元件的特异位点( a t t l ) 处进行基因重组。I 类整合子通常由57 和3 保守末端及中间的可变序列组成，5 保守末端携 带有编码整合酶的基因i n t l 、重组位点a t t l 和一个启动子的基因片段。基因盒在整合酶的作用下重组到具有同源性的短序列( a t t l 或a t t C ) 之间，耐药基因发生扩散。在铜绿假单胞菌、不动杆菌中，金属酶基因和氨基糖苷类修饰酶基因通常位于同一个整台子中，从而介导细菌的多重耐药。1 2I 忡类金属酶I M P 类金属酶在G e n B a n k 上登录的有2 0 种，但在P u b m e d 中可查到文献的只有1 1 种。i m p 一1 7 仅在 ! 堕业：二! ! 幽! 坐业：丝型盟! 鲰塑1 ：b 竖a s 凼i b ! 照一上提交。 1 9 9 1 年，日本的W a t a n a b e 等。”首次报道：从一株1 9 8 8 年分离的铜绿假单胞菌中发现质粒介导的金属酶，当时作者只研究了它的生化特性，但未测序，该酶后来证实为I M P 一1 。1 9 9 4 年，O s a n o 等“3 对1 9 9 1 分离的一株粘质沙雷菌的金属酶基因进行序列分析，并将其正式命名为I M P I ，其编码基因在染色体上。1 9 9 6 年，在新加坡的一个2 5 岁的A L 患者血培养中分离到一株对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌( 亚胺培南、美洛培南的M I C 1 2 8 u m 1 ) 。其产生的酶也是I M P 一1 ，编玛基囡位于1 5 0 k b 的可转移的大质粒上。该酶水解底物包括碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类以及氧头孢烯类抗生素，但不包括单环内酰胺类( 氨曲南) “1 。 I 仰一I 还可见于洋葱假单胞菌、鲍曼不动杆菌、皮氏假单胞菌、木糖氧化产碱杆菌及肠杆菌科细菌，表明I M P 一1 可在不同的细菌中水平传播。I M P 2 是1 9 9 9 年在意大利发现的，菌株来自1 9 9 7 年分离到的鲍曼不动杆菌，与I M P 一1 的同源| 生为 8 5 9 ，有3 6 个氨基酸不同，其中1 0 个位于引导肽“，但参与结合z n ”的保守氨基酸( H i s8 6 H is 一8 8 A s p 一9 0 H i s 一1 4 9 ，C y s1 6 8 ， 1 is 一2 1 0 ) 都相同”。b l a l M P 一2 也位于整合子上，其“5 9 b p片段”与b l a l M p 一1 的不同，表明这两种基因来源不同。I M P 一2 与I M P1 的对大多数的水解底物有相同的酶动力学参数，但对氨苄西林、羧苄西林、头孢噻啶、美洛培南等有显著差异，水解能力降低。2 0 0 0 年日本从福氏志贺菌中发现质粒介导的I M P 一3 ( ( 以前曾命名为M E T 一1 ) ，其编码基因位于接台性质粒上的I 类整合子中。与I M Pl 相比有7 个碱基不同，其中3 1 4 、6 4 0 位碱基突变引起氮基酸改变，G l u ( 8 7 )一G l y ，S e r ( 1 9 6 ) 一G 1 y ”。2 0 0 1 年在日本粘质沙雷菌中发现I M P 一6 ，也由质粒介导，与I M P 一1 只相差一个氨基酸，S e r ( 1 9 6 ) 一G l y ，与I M P - 3 有相同的突变位点。该位点突变导致酶对美洛培南、帕尼培南水解能力增强，而对砸胺培南、青霉素、哌拉西林水解能力则较弱“。5 8广州白云山制药股份有限公司大会报告香港C H U 等“从1 9 8 41 9 9 8 的分离到的不动杆菌中发现i M P 一4 ，其编码基冈不在质粒上，而在一段染色体的插入序列中。I M Pq 与I M P l 的同源性为9 5 ，6 。但也有一些突变位点与I M 卜2 相蚓，如A r g ( i 1 0 )- - G i n ，T h r ( 1 3 3 ) 一L y s ，儿e ( 1 9 1 ) - - L e u 。I M P4 还发现于C i I ，r o b a c t e ry o u n g a e 中，质粒介导，能通过接台试验把耐药性传给大肠埃希菌“。I M P 一5 发现于葡萄牙，来源丁病人的尿标本，对头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南耐药，倜对氨苄【崎林舒巴坦、氨基糖苷类和喹喏酮类抗生素敏感。与I M P 一1 的同源性为9 3 ，其编码基因位于I 类整台子中“。1 9 9 5 1 9 9 6 年，在加拿大艾伯丁市某医院的2 个康复病房发生了多重耐药的铜绿假单胞菌的爆发流行， 涉及9 名患者，该菌对碳青霉烯类、氨基糖苷类、环丙沙星、头孢他啶耐药，但对哌拉西林敏感。1 9 9 6年末该医院的康复项目引入该市的多j 一家医院，结果1 9 9 7 年卜1 0 月，从1 5 个病人的尿、伤口等部位分离到与该医院相同的亚胺培南耐药铜绿假单胞。经克隆分子技术，该耐药菌产生I M P7 ，与I M P1 同源性为9 1 ，其编码基围位于一个同时含编码氨基糖苷修饰酶基因的整合于中”。I M P8 是I M P2 的突变酶，只差4 个氨基酸”“。，由台湾的Y A N 等人从一栋多重耐药的肺炎克雷伯菌中分离到，由质粒介导。2 0 0 2 年在日本发现I M P 一1 0 1 ，与I