中国协和医科大学博士学位论文用BAC介导的转基因鼠研究人与珠蛋白基因簇的表达调控姓名：沈伟申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：梁植权;刘德培20031201中国协和医科大学博士学位论文用B A C 介导的转基因鼠研究人伐与p 珠蛋白基因簇的表达调控摘要人类珠蛋白基因家族分为a 和B 两个基因簇。位于第1 6 号染色体短臂上的c 【一珠蛋白基因簇以5 一、 f 一v 一( 】【z a i O 3 掣嗅序排列，其中0 为胚胎型功能基因，c 【为胎儿型和成年型功能基因，全长约4 0 k b ；位于第1 1 号染色体短臂上的p 一珠蛋自基因簇以5 - - 、j ，p 6 p 3 顺序排列，其中e 为胚胎型功能基因，和为胎儿型功能基因，p 为成年型功能基因，全长约5 0 k b 。珠蛋白基因在个体发生中表现为依次表达，并具有高度的组织特异性和发育阶段特异性；两类珠蛋白基因的终产物间始终维持平衡。珠蛋白基因的转录受编码基因与其旁侧序列甲基化程度、顺式作用元件、细胞内反式作用因子和染色质结构的调节控制。p 珠蛋白基因座控制区( L o c u sc o m r o lR e g i o n ，L c R ) 位于基因上游，由四个红系特异性的D N a s eI 高敏位点( H s ) 和一个非红系特异性的H s ( 功能有争议) 组成，它们对于6 一珠蛋白基因簇内各个珠蛋白基因在红系组织细胞中的高表达是必需的。珠蛋白基因簇上游亦存在类似的一系列高敏位点( P o s i t i v ec o 曲0 1E l e m e n t ，P C E ) ，参与调控c 【样珠蛋白基因的表达。转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组中稳定整合并能遗传给后代的类动物。利用转基因动物研究真核基因的表达调控可以在分子水平上设计实验，从四维时空观察转基因的整体效应。此外，利用转基因动物技术可以建立人类疾病相关基因的转基因动物模型，以探讨异常基因的表达调控规律。近年发展起来的建立在大肠杆菌F 因子基础上的细菌人工染色体( B a c t e r i a l A n i f i c i a lC h r o m o s o m e ，B A C ) 载体，可携带长达3 0 0 k b以上韵外源D N A 片段。使人们得以利用包含完整基因簇的大片段D N A 进行转基因动物研究，克服以往小片段重组体转基因实验中忽略基因间或调控元件之间相互作用的缺陷，从而研究大片段基因簇的表达调控规律。B A c 载体的中国协和医科大学博士学位论文2遗传特性稳定，不易发生缺失和重组：制备和纯化方法简便快速：可直接进行D N A 测序分析；载体上的稀有限制性内切酶N o t I 位点可以方便地线性化B A cD N A 并去除载体片段，具有粘粒( c o s m i d ) 、酵母人工染色体( Y e a s iA r i t m c i a lC l r o m o s o m e ，Y A C ) 等其他大容量载体不可比拟的优越性。因此在人类基因组计划和基因表达调控等研究领域，B A c 文库获得了广泛的应用。本研究首先利用温度敏感型穿梭载体( s h u t t l ev e c t o r ) 介导的同源重组的方法，修饰含全长人B 珠蛋白基因簇及一段I L 1 1 受体c 【链基因的B A c克隆，经氯霉素( C h l ) 正筛选和镰孢菌酸( F A ) 负筛选，获得发生两次同源重组后只含修饰后B A cD N A 而穿梭载体已丢失的菌株。经脉冲场凝胶电泳( P u l s eF i e l dG e lE 1 e c t r o p h o r e s is ，P F G E ) 鉴定后，大量提取并纯化B A cD N A 后，用N o t I 酶切分离出包含完整人D 一珠蛋白基因簇的插入片段，经s e p h a r o s ec L 一4 B 柱凝胶过滤层析快速分开了插入D N A 片段和载体D N A ，选择合适浓度的D N A 经显微注射制作转基因小鼠，并成功地建立了相关的转基因动物。核酸酶保护实验( R N a s eP r o t e c t i o nA s s a nR P A ) 结果显示含完整人L c R 结构的转基因小鼠体内的人B 类珠蛋白基因表达呈现正确的组织特异性和发育阶段特异性，I L 1lo 【链受体基因的有无并没有影响转基因鼠体内的人B 类珠蛋白基因发育阶段特异性表达。但在H s 5 缺如的转基因鼠中，人Y 珠蛋白基因不表达，进一步证实L c R 结构的完整性对B 珠蛋臼基因簇的表达调控至关重要。为探讨L c R 与P c E 对两类珠蛋白基因簇表达调控模式上的差异，采用改良的E TC 1 0 n i n g 同源重组技术，分别修饰B A C l 8 6 D 7 及B A c l 9 1 K 2 克隆，构建含L c R 与0 【结构基因的重组体，获得9 株转基因鼠。收集4 株外源基因单拷贝的转基因鼠胚胎组织，检测q 一类珠蛋白基因的表达情况。结果表明：1 )人一珠蛋白基因的转录在胚胎期正常开启( 表达量8 ，5 天与9 5 天最多，以后逐渐减少) ，成年期关闭。2 ) 人口。珠蛋白基因在转基因小鼠的整个胚胎发育中持续表达，但成年期表达水平明显高予胚胎期，这与鼠内源c 【基因表达模式相似。3 ) 人a 珠蛋白基因仅在1 2 5 天胎肝中才出现表达，且表达量较之嘞珠蛋自低。4 ) 4 个株系转基因鼠的入n 珠蛋自基因表达水平存在差异，其中有一株不表达，其余3 株分别为鼠内源珠蛋白表达水平的3 0 一1 4 0 ，说明外源基因位于染色体的不同整合位点环境对其表达水平有影响，缺乏整合位点不依赖性。中国协和医科大学博士学位论文3综上结果说明：1 ) 利用温度敏感型的穿梭载体经同源重组，成功删除了位于嵌合体B 5 一B A c 克隆中I L 一1 l 受体值链基因，建立了相关的转基因鼠模型。2 ) I L 一1 l 受体e l 链基因的有无并不影响B 珠蛋白基因的发育模式及表达水平。但L c R 中H S 5 的缺如，使y 珠蛋白基因在胚胎发育中不表达。3 ) 利用改良的E Tc l o n i n g 同源重组技术，构建了含L c R 与反向旺结构基因的重组体，获得9 株转基因鼠。4 1 上游调控序列L C R 取代P C E 后，并没有影n 向距离L c R 最远的人一珠蛋白基因表达的发育模式，但较正常c l 转基因鼠的关闭时相提前。说明人。珠蛋白基因对上游调控序列的依赖性较小，而受邻近序列的影响较大，如启动子序列，3 一非翻译区序列等，更倾向于自我调控。人Q 珠蛋白基因的开关受到影响，表现在人吐2 珠蛋白基因在转基因小鼠的整个胚胎发育中持续表达，但成年期表达水平明显高于胚胎期，与鼠内源基因表达模式相同，然而人口。珠蚤自基因仅在成年期表达，且表达量较之d ：珠蛋白低。此外，4 个株系转基因鼠的人旺类珠蛋白基因表达水平存在差异，其中有株不表达，说明外源募因位于染色体的不同整合位点环境对其表达水平有影响，缺乏整合位点不依赖性。中国协和医科大学搏士学位论文4S t u d yo ft h eR e g u l a t i o no fc l u s t e r e dg e n e se x p r e s s i o nA b s t r a c tT h eh u m a ng l o b i ng e n ef a m i l yc o n s i s t so f0 【一a n dD g l o b i ng e n ec l u s t e r sT h e戗一g l o b i ng e n ec l u s 把fl o c a t e so nt h es h o r t 黜o fc l r o m o s o m el6a n da r r a n g e di nt h eo r d e ro f 5 一( 一V ( 一v c c - 仪2 一d l - O 一3 ，S p a n n i n ga b o u t4 0 k b ；t h eD - 9 1 0 b i ng e n ec l u s t e ri so n 也es h o r ta r mo fc h r o m o s o m e11a n di nt h eo r d e ro f5 _ - 一 丫v p 6 一p 一3 ，s p a r m i n ga b o 眦5 0k b T h ee x p f e s s i o n so f9 1 0 b i ng e n e sa r ec h a r a c t e r i z e db y1 )s e q u e m i a le x p r e s s i o no fi n d i v i d u a lg e n ei ne a c hc l u s t e r ，2 )e r y t h r o i d s p e c i 6 ca n dd e V e l o p m e n t a ls t a g e s p e c i f i ce x p r e s s i o n ，3 ) b a l a n c eb e t w e e nd - 1 i k ea n dp l i k e心o b i nc h a i n s T h et r 弧s c r i p t i o no fg l o b i ng e n e si sr e g u l a t e db yt h ec h r o m a t i ns t r u c t u r e ，m e t h y l a t i o no fg l o b i ng e n e sa n dm e i rn a n k i n gr e g i o n s ，1 0 c a la 1 1 dd i s t a Ic i s a c t i n ge l e m e n t sa n dc e l l u l a rt r a I l s - a c t i n gf 如t o r s L C R ( L o c u sC o n t r o lR e g i o n )c o n t a i n i n gf o u re r y i d s p e c i f i ch y p e r s e n s i t i V es i t e sa n do n en o n e r ”h r o i d s p e c i n ch y p e r s 吼s i t i v es i t ea n dl o c a t e d6 2 0 k bu p s t r e a mo ft h e一g l o b i ng e n e ，i sg e n e r a l l ya c k n O v 以e d g e dt ob en e c e s s a r yf o r t h eh i g hl e v e le x p r e s s i o no fg l o b i ng e n e si ne r y _ t 】椭i dt i s s u e s I na d d m o n ，as e r i e so fh y p e r S e n s i t i V es i t e s ( P o s i t i v eC o n 睡o lE l e m e n t ，P C E ) 1 0 c a t e da tt h eu p s t r e a mo f一9 1 0 b i ng e n e ，a r es o m e w h 砒l i k eL C Rt or e g u l a t et h ec 【一1 i k e9 1 0 b i ng e n e