大会发言B 1 补肾通络方对去势大鼠阴茎组织N O S 基本表达的影响空军总医院( 1 0 0 0 3 6 )胡海翔王枯蔡庆1 材料与方法1l 药品和试剂补肾通络方由枸杞子、淫羊藿、炙蜈蚣、川芎等药物组成。由空军总医院药剂科提供，按传统方法将中药浸泡1 h 文火煎2 次，去渣合并、过滤、浓缩成含生药l g m l 的煎剂，4 保存备用。丙酸睾酮注射液由上海第九制药厂生产，批号0 0 9 0 0 1T R I Z O L 总R N A 提取试剂盒，M M L V 反转录酶和T a q D N A 聚合酶分别为美国G i b c o B R l公司、美国P r o m e g a 公司产品。1 2 实验动物分组及给药方法成年S D 雄性大白鼠4 0 只( 1 8 0 - - 2 5 0 9 ) ，由北京医科大学实验动物中心提供。4 0 只大白鼠随机分为对照组、去势组、补肾通络方组及丙酸睾酮组四组，每组1 0 只，去势组、补肾通络组及丙酸翠酮组经1 戊巴比妥钠3 5 m g k g ，腹腔麻醇后，作阴囊正中切口，切除双侧睾丸。术后2 周，朴肾通络方组，用补肾通络方灌胃，2 r n l 次，每天1 次，共灌胃l 周，丙酸睾酮组，用丙酸睾酮肌注，剂量为4 5 m g k g ，每天1 次，共肌注4 天1 3 实验方法4 天和1 周后大鼠分别断头处死，迅速取一定的阴茎组织，用1 、R I Z O N 总R N A 提取试剂盒提取阴茎组织总R N A 具体步骤：取阴茎组织1 0 0 m g ，用l r r d T R I Z O N 液匀浆研碎组织，室温放置5 r a i n ，加0 2 m l 录仿，振荡混匀，室温放置2 - - 3 r a i n ，1 2 0 0 9 离心1 5 m i n ( 4 * C ) ，转移水相，加0 5 m l 异丙醇沉淀R N A ，室温放置2 0 r a i n ，同上离心，弃上清，用7 5 乙醇漂洗R N A ，7 5 0 0 9 离心m i n ( 4 ) ，干燥后用适量D E P C 水溶解。用紫外分光光度计( 日本岛津U V 2 2 0 1 型) 测定总R N A 浓度和纯度，重复测定3 次，O D 2 6 0 和O D 2 8 0 之比值应在1 8 2 0 之问，计算样品总R N A 浓度。取总R N A 2 t t g ，在6 5 “ C 变性5 r a i n 后，依次加入5x 反转录缓冲液4 p l ，D N T P 0 5 m m o l L ，R a n d o n P r i m e r 0 5 p g ，M M L V 反转录酶u ，总反映体积2 0 , 1 。在3 7 * ( 2 加热1 0 r a i n 终止反应。参照B r e d t 等( 2 ) 发表的大鼠N O S 引物序列，合成其寡核苷酸引物。选用看家基因作为甘油醛一3 一磷酸脱酶( G A P D H ) 基因作为内参照，以校正计算E T 一1 和i N o Sr n R N A 含量G A P D H 引物序列参照K a n e t o 等( 3 ) 。所用引物由军事医学科学院三所合成并纯化。P C R 扩增：反应总体积为3 0 p l ，其中含反转录反应液2 p l ，1 0 P C R 缓冲液3 脚，4 种d N T P 各0 2 m m o l L ，上下游引物各0 5 9 m o l L ，T a q D N A 聚合酶1 5 U 。将反应管置于P C R 仪( 美国一4 2P e r k i n E l m e r9 6 0 0 型) 上，9 4 预变性2 m i n 后进入9 4 1 2 变性1m i n ，6 0 6 1 2 退火l m i n ，7 2 延伸1 5 m i n 的循环，共3 0 次，最后7 2 充分延伸7 m i n 。反应完成后取1 5 p I P C R 反应液，经2 琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕后在紫外线灯下观察照相，用凝胶成像系统密度分析P e R 产物带。为消除系统及定量误差，N O S m R N A 的表达水平以N O S的相对表达量即N O S G A P D H 比率来计算。2 结果大鼠阴茎组织总R N A 经反转录后用设定的引物进行P C R 扩增，其产物长度5 9 9 b p ，与引物设计相符。R N A 产物不经反转录，直接进行P C R ，电泳未见特异性扩增条带。而各组大鼠阴茎组织N O S m R N A 的P C R 产物电泳条带则显示明显的不均一。去势组电泳条带浅暗，丙酸睾酮组、补肾通络方组的电泳条带比较明亮，对照组最为明亮。密度扫描分析，在各组N o 心N A 相对表达量比值比较的研究中可以看出，去势组的N O S m R N A 比值明显低于对照组( P 0 0 5 ) ，丙酸睾酮组，补肾通络方组的N O ：s m R N A 比值无明显整异( P 0 0 5 ) 。3 讨论近年来的研究表明，阴茎海绵体平滑肌的舒张是产生勃起的关键，而这种舒张是在N O 的调节下完成的。高冰等( 3 ) 观察到A c l l 通过诱导内皮细胞产生的介导犬阴茎血管及海绵体组织浓度依赖性舒张效应。胡礼泉等( 4 ) 证实N O 除介导阴茎海绵体内皮细胞依赖性胆碱能舒张外，还可通过非胆碱能非肾上腺能( N A N C ) 神经纤维释放N O 作用于海绵体平滑肌细胞。而雄激素在阴茎勃起中也发挥着重要作用。S h a b m g h 等( 5 ) 发现去势大鼠的阴茎重量明显减轻，H E 和P C N A 组织化学染色显示阴茎组织中出现细胞凋亡。去势后经给予睾酮替代治疗，阴茎重量恢复，D N A 合成增加，表明雄激素可通过细胞程序性死亡和细胞增生来维持阴茎海绵体正常的组织学结构。本实验结果表明，补肾通络方、丙酸睾酮对大鼠阴茎组织中N C k S 活性起调节作用，大鼠去势1周后，其N O S 活性下降，也说明阴茎N O S 活性对补肾通络方、丙酸睾酮有依赖性，其确切机理有待进一步探讨。补肾通络方中淫羊藿和丁香有兴奋下丘脑垂体一肾上腺轴的功能，尤其是淫羊藿能促进阳虚动物的核糖、蛋白质合成，并具有雄性激素样作用，其它几昧药则为活血通络、疏肝之辅佐药。应用结果表明。补肾通络方能通过调节N O S 活性而在阴茎勃起中发挥重要作用。提示该方药对各种因素( 年龄、糖尿病、高血脂等) 引起的神经变性及内皮细胞损害导致阴茎组织中N O S 基因表达水平下降，使N O S 活性降低而N O 生产量不足，从而影响阴茎血管及海绵体平滑肌的舒张所致的勃起功能障碍，并起到较好的治疗作用。一4 3