率明显高于I T P 患儿与正常儿童，而中表达型有6 例( 2 0 ) ，其发生率与I T P 患相同，但明显高于正常儿童，高表达1 6 例( 5 3 3 ) ，其发生率明显低于对照组( 1 ) ( 2 ) 。对红细胞免疫调节功能检测结果表明：A I 患儿红细胞C R l 活性下降，血清中R B C C 3 bR F I R 上升，它是一种糖蛋白可以抑制红细胞C R l 粘附活性，从而减弱红细胞免疫功能。本研究结果提示：A I 工1 患儿的发病与红细胞C R l 基因型发生突变有关，与红细胞C R l 活性的降低及红细胞免疫抑制因子的升高有关。卒结果为A L L l 患儿采用基因重组可溶性C R l 治疗提供了理论依据。因此寻找提高红细胞免疫及其调节功能的药物，是今后防治A L L l 的一大方向。参考文献1 郭峰等。红细胞免疫学新探( 上卷) 。南京：南京大学出版社，1 9 9 3 。1 0 5 1 0 62 郭峰等。红细胞免疫功能的初步研究。中华医学杂志，1 9 8 2 6 2 ：7 1 5 7 1 6 。3 郭峰。红细胞免疫及其调空功能的测定。免疫学杂志，1 9 9 0 ，1 ：6 0 - 6 54S i n g e II , L i uT L , G i e i c h e rN T h er e d - - c e l li m m u n es y s t e m L a n c e t ，l g S l ，2 ：5 5 6 - - 5 5 9 标本扩增效率的计算及其对H B VD N A 定量结果的影响陈英剑胡成进克丙申济南军区总医院实验诊断科济南2 5 0 0 3 1摘篓目的：建立分析标本扩增效率的方法，分析其对H B VD N A 定量结果的影响。方法：应用分析软件提供的样点拟合法及对数荧光一循环数座标图，计算得到C t 。H B VD N A 拷贝数以及每一标本的扩增效率。分析4 0 个H B VD N A 拷贝数在1 0 4 - 1 0 8 1 m l l 勺, 标本的扩增效率，并用得到的标本实际扩增效率加以校正。结呆：4 个标准的扩增效率分别为0 8 0 0 8 0 ，0 8 4 和0 8 5 。标本的扩增效率在0 5 9 0 8 5 之阿，其中3 0 份( 7 5 9 ) 在0 7 0 8 5 之间，8 份( 2 0 9 ) 在0 6 5 0 7 0之间，其余2 份在0 6 5 P , 下。部分校正后的H B VD N A 定量结果比校正前高一个数量级。结论：标本与标准的扩增效率不一定相同，标本扩增效率的降低导致标准曲线定量结果偏低，有必要用标本的实际扩增效率对结果进行校正。关键词聚合酶链反应；扩增效率；乙肝病毒大多数人认为P C R 反应中D N A 模板以指数形式复制，但由于反应体系中酶抑制物的存在，试剂的消耗以及焦磷酸盐的积聚等因素，使得P C R 在一定循环后不再以指数形式复制，一些反应的产物会比另一些反应多。所以终点法的定量结果不可信。因此，诞生于十九世纪九十年代中期的核酸定量方法一实时P C R 很快就成为了一种非常受欢迎的分子生物学技术。实时P C R 是P C R 技术与荧光技术相结合的产物。1 9 9 3 年，H i g u c h i ”1 等利用D N A 结合荧光染料实 时监测D N A 扩增过程，开辟了动力学P C R 的先河。由于可以在产物聚集时检测产物的量即实时检测，使得可以在指数扩增期的某一点检测P C R 产物量。在P C R 初始几个循环，荧光信号变化很少。将这一部分设定为基线，荧光增加高出基线时，可以检测聚集的P C R 产物量。在基线之上设定一特定的荧光闻值，循环阈值( C t ，c y c l et h r e s h o l d ) ，即为荧光信号达到阈值时的循环数。C t 值与初始模板数有特定的关系，是核酸定量的基础。3 1 6 迄今为止，所有应用C t 值的计算方法都是在假定靶基因的扩增效率在不同的标本与标准之间是相同的、从扩增开始到结束是一成不变的前提下进行的。然而事实并非如此。许多临床标本有可能被 各种各样的P C R 抑制物所污染。如D N A 片断肝素9 域血红蛋白”1 等P C R 抑制物都会降低扩增效率。 目前H B VD N A 定量已成为监测治疗效果的常规手段，应用越来越广泛。但尚无人分析病人标本与标准问的扩增效率是否相同或近似以及扩增效率的微小差别差别对检验结果的影响。本研究应用一种可以分析扩增效率的简便方法，表明标本与标准的扩增效率之间存在差别，标本的扩增效率经常会低于标准的扩增效率，使得检测结果偏低。使用用得到的扩增效率对由标准曲线计算出的结果加以校正可以得到更可信的结果。 1 材料与方法1 1D N A 提取与妾时P C R 分析病人H B VD N A 提取按照试剂盒( 深圳匹基) 操作说明进行。实时P C R 扩增和结果分析应用杭州博日荧光定量P C R 检测系统( L i n e G e n eF Q D 一3 3 A ) 。P c R 条件为：3 7 0 C5m i n ，9 4 0 C1m i n 后，9 5 0C1 5s 6 0 0 C3 0 s 循环4 2 次。6 0 0 C 单点采集荧光信号。结果分析采用样点拟合法，选择2 点。1 2 实时P C R 动力学与扩增效率的计算在P C R 指数扩增期产物的积累可以用公式1 描述“：N c = N 。f 1 + E ) c1式中N 。代表经过C 个循环后的产物量，N 。代表初始模板数，E 代表平均扩增效率。P C R 反应中E最大为l ，此时每一循环产物增加倍；最小为0 ，扩增没有进行。对公式1 取对数将其线性化，得到公式2 ：L o g ( N c ) = L o g ( N + C L o g ( I + E )2此处N 。代表c 个循环后荧光检测值。样点拟合法正是利用扩增曲线的指数期，将荧光值取对数后取两个点得到一条直线( 图1 ) ，将直线延伸与阅值的交叉点定为c t 倒“。从公式2 可以看出这些直线的斜率( s ) 即为L o l l + E ) ，因此可以由这些直线的斜率计算出扩增效率( E = 1 0 - 1 ) 。】o d I b m , t K _ 1 J ，钐驴 7 71 3 结果的校正在公式1 中，当c 为c c 时，M 代表阂值。而冈僮是固定的，所以有：N o c o 髓( 1 + E c ) 。= N 时( 1 + E 书o N 。o m 和N m 分别为校正后及有标准曲线得到的H B VD N A 拷贝数，E n 为标准的平均扩增效率，E c为标本的实际扩增效率。将上述公式重新排列得到公式3 ：N 0 c o n - N “l + E 曲( 1 + E c ) r33 1 7o 山咖口r 山叫m n线曲。竹环循一。撒荧。嫩2图。一m口1 4 扩增效率降低的因素分析用d H 2 0 X 口2 个扩增效率低于0 6 5 的标本1 0 倍系列稀释( 1 ：1 ，1 ：1 0 和1 ：1 0 0 ) 后提取D N A 检测。 2 结果2 1P C R 扩增效率的差异用上述方法分析了4 个标准和4 0 份H B VD N A 拷贝数在1 一1 0 8 m l 的标本的扩增效率。标准的扩增效率分别为0 8 0 ，0 8 0 ，0 8 4 和0 8 5 。标本的扩增效率t o 5 9 0 8 5 之间，其中3 0 份( 7 5 ) 在0 7 。0 8 5 之间，8 份( 2 0 ) 在0 6 5 0 7 0 2 ；问，其余2 份标本在0 6 5 以下。2 2P C P , 扩增效率的影响分析从公式3 可以看出，扩增效率的差别对定量结果的影响是l , g c t 值为幂的，因此小的扩增效率差别就 会造成定量结果数倍的差别。如果标准的平均扩增效率为0 8 0 ，不同的扩增效率对不同C 值的标本定量结果影响不同( 表1 ) 。可以看到扩增效率0 2 的差别可以导致检测结果被低估1 0 倍以上。表1P C R 扩增效率的影响2 3 结果的校正使用标准平均扩增效率O 8 2 ，应用公式3 校正了由标准曲线得到的结果。校正后的结果是校正前结果的l 1 51 倍。扩增效率高于0 7 0 的标本被低估的倍数在I - 4 7 5 ，低于0 7 0 的标本被低估的倍数在38 1 5 1 。表2 列出了扩增效率校正前后的结果。可以看到部分校正后的H B VD N A 定量结果比校正前高一个数量级。表2 扩增效率低于0 7 0 的标本校正前后的H B VD N A 定量结果2 4 扩增效率降低的因素分析由图2 可以看出标本稀释后，3 条直线是平行的，斜率无明显差别，因此扩增效率基本无变化。标本1 稀释前后的扩增效率均为0 6 3 ，标本2 的扩增效率为0 5 9 ( 1 ：1 ) ，0 6 2 ( 1 ：1 0 ) ，0 5 9 ( 1 A 0 0 ) 。3 1 8 I o d 岫l 够一 。”呈譬品器异辑霉霉品c m _ I b a图2 序列稀释的标本t 荧光对数一循环曲线从左到右分别为1 ：1 ，1 ：1 01 ：1 0 0 3 讨论P c R 技术与新的荧光技术的发展相结合产生了实时定量P C R 。此技术不依赖终点分析，终点分析 常由于产物的抑制、酶活性降低及反应成分的消耗而产生错误的结果。此外，实时P ( 瓦融蓟蹴甩宽( 一l o “) ，灵敏度高( 5 拷贝) ，无P C R 反应后处理步骤及精确度高( 辐酬“等优点。如4 “ 此t t 术已成为科技的主流，得到普遍认可。特别是无P c 皈应后处理步骤、可快速得到结果以及经济等特点，使得其在临床诊断应用颇受欢迎。随着实时定量P c R 扩增仪的增加及仪器和试剂价格的降低。该技术应用会越来越普及。 目前几乎所有的实时P C R 仪的结果分析方法都是以c t 值为基础。而应用c t 值的计算方法女睫在假定靶基因的扩增效率在不同的标本与标准之间是相同的、从扩增开始到结束是一成不变的前提下进行的1 。然而事实并非如此。许多临床标本有可能被各种各样的P E R 抑制物所污染。如D N A 片断。肝素或血红蛋白等P e R 抑翩物都会降低扩增效率。经过4 2 个循环的扩增后，扩增效率的微小差别会导致定量结果的巨大差异。在扩增效率为1 o的情况下D N A 数量每一循环增加l 倍，而扩增效率为0 9 时，D N A 数量每一循环增加0 9 倍在0 8 和o 7 的扩增效率下，D N A 数量每一循环只增加0 g 和0 7 倍。其影响依赖循环数，如橱钵的c t 值2 5 ，扩增效率为o 6 ，标准的平均扩增效率为0 g ，从表l 检测结果会比实际结果低1 9 倍。如果可以计算出预计的误差则可以对结果加以校正。因此，有必要建立一种可以计算标本扩增效率白g ：方法。实时P C R 可以分为3 个时相：对数增长期( 或l o g 期) 、线性期及平台期“。在P C R 指数扩增期，产物的积累可以用公式1 描述：N c = N o ( 1 + E ) 6 。取对数将其线性化，得到公式2 ：L o g O 叼= h g ( N )+ L o g ( I + E ) c 。样点拟合法正是利用扩增曲线的指数期，将荧光值取对数后取两个点得到条直线，而此直线的斜率( B ) 即为L o g ( Z + E ) ，因此可以由直线的斜率计算出扩增效率( E = 1 0 - 1 ) 。分析4 个 标准和4 0 份H B VD N A 拷贝数在l O 。1 0 。m l 的标本的扩增效率，结果显示标本与标准的扩增效率存在差异，从而导致部分F I A B V D N A