第2 4 卷增刊分析测试学报V I 2 d 堑竺堑! ! ! 些竺竺型坠! 塑型篁坠竺型! ! 些塑! 堡竺海洋微藻中游离醛、酮糖差异衍生的G C M S 分析叶芳挺，严小军，徐继林，陈海敏( 宁波大学浙江省海洋生物工程重点实验室，浙江宁波3 1 5 2 11 1近儿年随着糖生物学的发展，对糖类的研究越来越关注。糖在生物体内的功能不仪限于提供能量和参与结构，还具有各种生物活性功能：抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血酯”2 。等。这也同时对糖类研究技术提出了更高的要求。单糖的组成分析是糖类学研究的基础，其中利用G C M S 刑单糖的组成进行分析是目前应用最广泛的一种方法。有着分辨能力高、分析速度快和灵敏度高等优点3 j 。但是由于糖本身没有足够的挥发性，因此上机分析前需预先转化成易挥发、对热稳定的衍，丰物。目前常用的糖的衍生方法有糖的三甲基硅醚衍生，糖腈乙酸酯衍生，糖醇乙酸酯衍生等等这些方法各有优点又有着自身不可忽视的缺点：三甲基硅醚衍生产生的异构峰较多，给定性和定量带来一定困难；利用糖腈乙酸酯衍生酮糖衍生物则得不到色谱峰；糖醇乙酸酯衍生操作过于烦琐且葡萄糖和山梨糖经过还原均得到山梨醇，果糖经还原可变成山梨醇和甘露醇的混合物，使得分析变得复杂”1 。由于许多样品中醛、酮糖是同时存在o 6o ，因此单独利用以上任一种衍生方法都无法得到完善的结果。本文综合以上几种衍生方法的优点，通过差异性衍生方法设计了一种可同时对醛、酮糖进行定性和定量分析的方法。并利用该方法对9 种海洋微藻中的游离单糖进行r 测定。1实验部分1 1 材料与方法1 1 1试剂、仪器与色谱条件采用S H I M A D Z U 公司Q P 2 0 1 0 型G C M S 联用分析仪，S U P E L C O公司的3 0mX 0 2 5m i l l 0 2 5p , mS P B 一5 0 色谱柱，S I G M A A L D R I C H 公司的单糖标准品，美国S U P E L C O 公司的H M D S + T M C S ，3 ：1 ( S y l o nH T ) K i t ，其他试剂国产分析纯。进样口温度2 5 0 ，载气为9 9 9 9 9 的高纯氦，柱流速1m L m i n ，初始柱前压2 6 3k P a ，柱起始温度1 0 0 ，保持3 5m i n ，以1 5 m i n 升至1 6 0 ，保持2 0m i n ，再以1 5 m i n 升至2 0 0 ，保持1 5m i n ，再以2 0 m i n 升至2 8 0 ，保持5m i n 。分流进样1p , L ( 分流比9 6 ) 。M S 条件：用电子轰击( e l e c t r o ni m p a c t ，E 1 ) 源分析，电子能量为7 0e V ，离子源温度2 0 0 ，接口温度2 5 0 。选取全程离子碎片扫描( S C A N ) 模式时，质量扫描范围为5 0 6 0 0U ，溶剂延迟3 5m i n 。选取特征离子碎片扫描( S I M ) 模式时，醛糖选用m z1 4 5 、酮糖选用m z2 1 7 为定量时的目标离子，另选两个离子作为定性时的参考离子。 1 1 2 样品处理称取5 0m g 左右微藻干粉样品于1 5m L 试管中加8 0 乙醇5m L 超声提取1 5m i n ，重复两次，合并提取液，浓缩于1 5m L 样品瓶。向1 5n i L 样品瓶中加入过量盐酸羟胺和0 5m L 吡啶密封混合均匀，9 0 水浴3 0r a i n 。水浴后各取两份2 5 L ，一份加入等量醋酸酐9 0 水浴3 0m i n ，吹干用二氯甲烷定容0 5m L ，上机分析。另一份加入等量的H M D S T M C S ( 1 ：3 )8 0 水浴1h ，吹干用正已烷定容0 5m L ，上机分析。根据样品中所含各单糖的特征离子信号响应强度，用外标法求出各单糖的含量。2 结果与讨论利用该方法1 1 种标准单糖在1 4 肛g m L 范围内线性关系嶷好，各单糖的线性方程分别为：鼠 李糖Y = 5 26 4 3 1 9 X ；核糖Y = 4 71 0 5 2 4 X ；阿拉伯糖Y = 4 37 6 7 8 6 X ；岩藻糖Y = 6 10 4 2 6 2 X ；木糖，= 4 47 2 3 1 4 X ；甘露糖Y = 3 97 5 0 1 盖；葡萄糖Y = 4 14 9 6 1 4 X ；半乳糖Y = 3 29 7 4 5 7 X ；果糖Y = 1 4 20 6 6 3 X ；山梨糖l ，= 1 7 46 3 0 3 X 。仪器检出限醛糖在8 1 5 2 2 3 9 g m L 之间、酮糖为2 3 2n g m L 和3 4 7 n g m L ，高、中、低3 个量的平均回收率为6 6 7 一9 5 7 ，相对标准偏差在基金顷目：蚓家科技部新药博士基金( 2 0 0 3 A A 2 2 3 5 1 1 ) ；国家自然科学基金重点资助项目( 2 9 9 3 2 0 3 0 )第2 4 卷分析测试学报增刊3 1 1 0 o 之问。对小球藻等9 种海洋微藻的游离单糖进行了测定结果良好。参考文赫：T A L Y S H I N S H YMM ，S O U P R O NYY ，H U U E I t 4 E LMMC a n c e rC e i lI n t e m a t l o n a l 2 0 0 2 ，2 ( 8 ) ：1 7Y O OS1 4 ，Y O O NFj ，C H AJ ，e n fI n k r n a t i o n a ll o u r n a lo fB i 0 1 d c a lM a c r o l x i o l e e u l e s 2 0 0 4 ，3 4 ：3 7 4 1 1 E H R F E L DJ A n a lB i o c h e m ，1 9 8 1 1 1 5 ( 2 ) ：4 1 0 4 1 8Z H A N GW e i j i e ( 张惟杰) B i o c h e m i s t r yT e c h n i q u e si nt h eR e s e a r c ho fC a r b o nC o r n p l e x ( 糖复合物生化研究技术) Z h e j i a n g ( 浙江) ：Z h e j i a n gU n i v e r s i t yP r e s s ( 浙江大学出版社) ，1 9 9 93 6 4 lF A N GY o a l a n ( 方幼兰) ，L I UY a n r u ( 刘艳如) I J NS h a o q i n ( 林少琴) J o u r n a lo fF u j i a nN o r m a lU n i v e r s i t y ( 福建师范大学学报) ，1 9 9 5 ，1 1 ( 2 ) ：6 7 7 3C H E NH a n q i n g ( 陈汉清) ，w uW e n l i ( 吴文礼) I , I NK u n m i n g ( 林昆明) J o u r n a lo fF u j i a nA g r l c u l t u r a lU n i v e r s i t y( 福建农业大学学报) ，1 9 9 4 ，2 3 ( 4 ) ：4 7 6 4 7 9 K E U K E N SHJ A E R T SMML ，T R A GWAA n a l y t i c a lS t r a t e g yf o rt h eR e g u l a t o r yC o n t r o lo fR e s i d u e so fC h l o r a m p h e n o c o li nM e a t ：P r e l i m i n a r yS t u d i e si nM i l k J A s s o cO f fA n a lC h e r a ，1 9 9 2 ，7 5 ( 2 ) ：2 4 5 2 5 6 S A N AML ，V I L L A M I E I ，M ，C A m OM F o o dC h e m i s 呻2 0 0 4 ，8 7 ( 3 ) ：3 2 5 2 3 8 D e t e r m i n a t i o no fA l d o s e sa n dK e t o s e sb yG C M SU s i n gD i f f e r e n tD e r i v a t i z a t i o nY EF a n g t i n g ，Y A NX i a o - j u n ，X UJ i l i n ，C H E NH a l m i n( K e yl a b o r a t o r yo f M a r i n eB i o t e c h n a l o g y ，N i n g b oU i i v e r s i t y ，N i n g b o3 1 5 2 1 l ，C h i n a )A b s t r a c t ：T oe s t a b l i s han e wm e t h o dt od e t e r m i n ea l d o s e sa n dk e t o s e ss i m u l t a n e o u s l y T h em o n o s a e c h a r i d e sw e r ee x t r a c t e dw i t h8 0 e t h a n o la f t e rs o n i e a t i o nf o r1 5m i na n dt h i sp r o c e s sw a sr e p e a t e dt h r e et i m e s T h ee x t r a c tw a se v a p o r a t e du n d e rv a c u u m S u g e ro x i m e sw e r ef a r m e du s i n gh y d r o x y l a m i n ea n dp y r i d i n eu n d e rh e a t i n ga l9 0 f o r3 0m i n A f t e rr e a c t i o n t h es a m p l ew a sd i v i d e di n t ot w op a r t s O n ep a r tw ；l t sa d d e dp y r l d i n ea n da c e t i ca n h y d r i d ef o rd e r i v a t i z a t i o na t9 0 f o r3 0m i n t h eu t h e rp a r tw a sa d d e dH M D S T M C Sf o rs i l y l a t i o nr e a c t i o na t8 0o C f o rlh T h et w op a r t sw e r ea n a l y z e db yG C M Si nS I Mm o d e a n di n o s i t o lw a su s e d si n t e r n a l , s t a n d a r d T h el i n e a r i t yi ss u p e r i o rf r o ml 一4 一m Lt h ed e t e c t i o nl i m i t o f