国外学者发现胸苷酸合成酶 (TS)是 5-FU 产生耐药的一个重要酶，癌组织中 TS 的表达水 平可以用于指导治疗并与患者的预后相关，TS 高表达患者对 5-FU 的敏感性明显高于低表 达者，TS 低表达容易对 5-FU 产生耐药性。胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)、胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS) 和二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)是细胞核酸代谢过程中起重要作用的三个酶，并且以不同的角度与 5-FU 相互作用而影响 5-FU 的疗效。TP 可逆性地催化胸腺嘧啶核苷转变为 2-脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶，即通过催化胸苷和胸腺嘧啶的相互转化而稳定细胞内胸苷的水平。进入体内的 5-FU 需经过 TP 的作用被活化后才具有抗癌作用，TP 还具有血管生成活性，与 PD-ECGF 是同一基因的转录产物。TS 是合成胸苷酸的限速酶，催化 dUMP 转化为 dTMP，而 dTMP 是 DNA 合成和修复所必须的胸腺嘧啶核苷酸的唯一来源，所以 TS 在细胞增生过程中发挥重要作用。TS 也被证明是 5-FU 作用的靶向酶，5-FU 就是通过抑制 TS 活性阻断 DNA 合成而发挥抗肿瘤的作用。DPD 是尿嘧啶和胸腺嘧啶分解过程中的第一限速酶，可降低用于 DNA 合成的尿嘧啶和胸腺嘧啶的水平而影响 DNA 的合成。DPD 同时也是降解 5-Fu 的最主要的限速酶，体内 5 一 FU 用量的 85%由此酶降解。.胸苷酸合成酶对结肠癌胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药影响的前瞻性研究化疗耐药影响的前瞻性研究【摘要摘要】 目的 探讨结肠癌对 5Fu 产生耐药的机理,从细胞培养水平上进一步论证胸苷酸合成酶对 5Fu 化疗产生耐药的影响。方法 应用 MTT 法对体外培养的 30 例结肠癌细胞进行 5Fu 药敏试验，再应用 SP 免疫组化法对 30 例结肠癌进行胸苷酸合成酶检测，然后将两个结果进行比较。结果 胸苷酸合成酶高表达组体外培养的结肠癌细胞对 5Fu 的敏感性明显低于 TS 低表达组。结论 胸苷酸合成酶表达程度的高低对临床结肠癌患者化疗药物的选择有一定的指导意义。 【关键词关键词】 结肠癌;MTT;免疫组织化学;胸苷酸合成酶（TS）;5Fu;细胞培养The Influence of Thymidylate Synthase (TS) in Colon Carcinoma used 5Fu Cure Prospective StudyCHEN Xin, LIN Wenbo, SHEN YouzhuDepartment of Pathology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China;Nanan Hospital of Fujian Province；1st Hospital of Zhaoan cityAbstract：Objective To investigate the reason of the 5Fu drug resistance, and to prove deeply the influence of TS in colon carcinoma with the level of cell culture.Methods To proceed the 5Fu drug susceptibility test with MTT method to 30 cases in vitro culture colon carcinoma cell; to be examined by SP immunohistochemical staining and observed the expression of TS; and then compare with them.Results In vitro culture colon carcinoma cells corresponding highexpression of TS the senility to 5Fu delay obviously than the lowexpression.Conclusion The positive expression of TS has a instruction significance in colon carcinoma patients at the election of chemistry drug.Key words：Colon carcinoma;MTT；Immunohistochemical;Thymidylate synthase (TS); 5Fu; Cellculture0 引言引言5Fu 广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切一直处于其他化疗药无法替代的地位，目前仍是肠道恶性肿瘤的首选化疗药。但一些结肠癌病例对 5Fu 为主的化疗并不敏感，为提高对 5Fu 原发性和继发性耐药患者的治疗效果，有必要从细胞水平上阐明 5Fu 耐药机制，找出能用于评价 5Fu 化疗敏感性的指标。1 材料与方法材料与方法1.1 材料 选取我院术前未进行 5Fu 化疗的结肠癌新鲜标本 30 例，其中男性 21 例，女性 9 例，再将所有结肠癌根治术标本经 10福尔马林液固定，石蜡包埋。1.2 试剂 RPMI1640 培养基干粉，胎牛血清,MTT，透明质酸酶胰蛋白酶，型胶元蛋白酶，DNA 酶，220nm 薄膜滤菌器，以上试剂均来自华美生物工程公司北京分公司。绵羊抗人 TS 蛋白单克隆抗体，AP 标记的兔抗绵羊二抗（美国 Rockland 公司），生物素代兔抗绵羊二抗（美国 K.P.L 公司）。SP 试剂盒，DAB 显色试剂盒（福州迈新公司）。1.3 方法1.3.1 肿瘤细胞培养 无菌条件下取手术根治切除的结肠癌组织，置于合有 500U/ml青霉素，500gml 链霉素清洗（10min）,将肿瘤组织剪成 1mm3 碎块后，置于含有型胶元蛋白酶（200U/g）型 DNA 酶（100U/g），型透明质酸酶（1 500U/g）的RPMI1640 培养基（4，20h）,离心（1 000r/min，5min）两次，收集单个细胞用RPMI1640 液将细胞洗两遍后，以 5105 个ml 活细胞数接种于培养瓶中，加入 20胎牛血清（FBS），置于 CO2 培养箱中（37，5CO2），次日培养细胞贴壁，3 天更换一次生长液，计算肿瘤细胞群体增倍时间（36h），不用传代，直接用原代细胞进行实验。将细胞悬液浓度为 2104ml 加入 96 孔培养板中，每孔 200l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，2h）；在 96 孔板中加入 5Fu（150gml），每孔 20l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，36h）；吸弃上清每孔加入 MTT 应用液（5mg/ml）20l，培养 4h 后，每孔再加 200l 的酸化异丙醇终止反应，以上步骤均严格遵循无菌操作原则，最后用酶标仪测定每孔及光度值（测定波长 540nm），以未加 5Fu 进行药敏的癌细胞为对照组。1.3.2 免疫组化染色 采用 SP 法进行免疫组化染色；将 30 例结肠癌石蜡切片脱蜡至水，无须抗原修复，直接浸入 3H2O2 内源性酶处理 10min，PBS 洗 35min；10正常羊血清封闭 10min，PBS 洗 35min；加一抗（绵羊抗人 TS 蛋白单克隆抗体 1300稀释）1h，PBS 洗 35min；加生物素标记的二抗（兔抗绵羊 1400 稀释）10min，PBS洗 35min；加 SP 溶液，10min，PBS 洗 35min； DAB 显色，苏木素复蓝，中性树胶封片。1.3.3 结果判断 TS 蛋白表达阳性区域在细胞浆中出现棕黄色的阳性颗粒。随机选取4 个中倍视野（1010），计算 400 个细胞浆中阳性细胞的百分数，当阳性细胞数目75为（+）。计算每例结肠癌细胞体外培养的 5Fu 药敏试验的抑制率（）：抑制率（）=（1-试验孔 OD540对照孔 OD540）1002 结果结果30 例结肠癌组织 TS 蛋白表达均为阳性，根据肿瘤细胞阳性数分为两组：高表达组（+），低表达组（+），见表 1。表 1 TS 蛋白高表达组与低表达组比较（略）表 2 TS 表达与体外培养的癌细胞 5Fu 抑制率的关系（略）从表 2 可以看出 TS 高表达组的体外培养癌细胞 5Fu 抑制率明显低于低表达组，差别具有统计上的意义（P0.05）。3 讨论讨论 5Fu 广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直处于其他化疗药无法替代的地位，但一些结肠癌病例对 5Fu 为主的化疗并不敏感，其对 5Fu 单药治疗的有效率仅 203，本文想通过体外细胞培养，从活细胞水平上论证胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药的影响。MTT 法的原理是以黄色的四氮唑盐可被活细胞线粒体中的与辅酶 NADP 相关的脱氢酶过厚，即接受氢原子而成为不溶性的甲铒替颗粒，而死细胞无此功能，无甲铒替颗粒形成，因此用酶标仪测定的 OD540 值越高，说明肿瘤细胞的耐药性越强，药物抑制率越低。胸苷酸合成酶（TS）是由两个相同亚单位组成的聚体蛋白质，每个亚单位的分子量为 36Kda，Hori 等研究发现 TS 基定位于为类第 18 号染色体上1。TS 的功能是催化尿嘧啶脱氧核苷（dUMP）甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP），这是 dTMP 从头合成途经中关键的步骤，而 dTMP 又是 DNA 的生物合成所必需的，因此，通过对 TS 进行抑制就能达到抑制 DNA 的生物合成,进而抑制细胞生长或增殖的作用。5Fu 正是通过对 TS进行抑制而发挥其抗癌活性的。5Fu 进入体内后经过一系列酶促反应，最后转变为其活性代谢产物 5氟尿嘧啶脱氧核苷（5FudUMP），它在辅因子 5,10亚甲基四氢叶酸存在下，能与 TS 结合形成等价的三联复合物 TSFdUMPCH2FH4，影响 dUMP 与 TS 的结合，从而抑制了 dTMP 的合成，使 DNA 的合成受限，导致细胞生长受到抑制甚至死亡1。许多学者研究表明，癌组织中 TS 的表达水平与患者的预后呈负相关，TS 的表达可以作为判断癌症患者预后的指标2, 47，Tachikawa 和 Takenoue 等对肠癌患者的研究结果显示 TS 低表达组对 5Fu 的敏感性优于高表达组，其预后也明显优于 TS 高表达组8,9。Copur 等10对人类 H630 肠癌细胞株与其继发 5Fu 耐药株H630R1,H630R10,H630R 等进行比较，结果显示随着细胞株耐药性的增加，细胞中的 TS 水平也明显增加，这也从另一方面说明了 TS 对细胞耐药性的影响。本研究课题从活细胞水平上对胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药的影响进行了更进一步的探讨，结果显示结肠癌 TS 高表达组的体外培养的癌细胞对 5Fu 化疗药物的敏感性明显低于 TS 低表达组的体外培养的癌细胞，这种差别具有统计学上的意义（P0.05），这说明 TS 高表达组的患者对 5Fu 化疗的敏感性可能明显低于 TS 低表达组，因此容易产生耐药，与文献报道是相符的，进一步论证了胸苷酸合成酶的表达程度对临床结肠癌患者在化疗药物上的选择有一定的指导意义。【参考文献参考文献】1 Hori T,Takahashi E,Ayuasawa D,et al.Regional assignment of human thymidylate synthase(TS) gene to