得以在3 6 生长。由于目的蛋白不用进入细胞核，该系统更适用于膜蛋白功能的研究。本研究成功构建G 1 G I 与R a s 羧基末端融合的诱饵蛋白载体。由于不清楚前导肽对该系统的影响，因此，同时构建了含前导序列的G l 和不含前导序列的G 1 分别与R a s 的嵌合基因，克隆人p M E T 2 5载体中。在蛋氨酸存在时，m e t 启动子受抑制，从而抑制了诱饵蛋白的表达，而在葡萄糖存在时，抑制了p Y E S 2 载体中G a l l 启动子，因而抑制了猎物的表达。因此只有在半乳糖( + ) 、M e t ( 一) 的平板上，两种质粒才能共表达，从而激活R a s 募集途径，使酵母细胞可在3 6 C 存活。共激活试验表明，两种嵌合基因均未能激活R a s 募集途径，表明所构建诱饵蛋白载体M E T - G 1 G 1 均可用于文库筛选工作。参考文献1G a v f i l o v s k a y a I N ，V m w n E J ，G i n s b e r g M H ，e t dC e l l u l a r e n t r yo f h a n t a v i m s e s w h i c hc a l l s eh e m o r r h a g i c f e v e r w i t hr e n a ls y n d r o m ei sm e d i a t e db yb e t a 3i n t o n s J lJ - V i r o L1 9 9 9 ；7 3 ( 5 ) ：3 9 5 1 3 9 5 92G a v r i l o v s k a y a1 N S h e p l e yM ，S h a wR ，e t 吐B e t a 3i n t e g r i n sm e d i a t et h ec e l l u l a re n t r y0 fh a n t a v i r u s e st h a tC a t t s er e s p i r a t o r yf a i l u r e J J P r o c N n 吐A e a d S e i U S A1 9 9 8 ：9 5 0 ：7 0 7 4 7 93V i r o l o g y 2 9 4 ，6 0 6 9 ( 2 0 0 2 )4董京芳，蒋郁青，王健伟等检测B3 整合紊基因在汉坦病毒敏感细胞中的表达【J 】中华实验和倚床痛辜学杂志2 0 0 2 ：1 6 ( 1 ) ：4 0 4 35M a z z u c e h e l l iR C o l w a s o eS 。V i o l i nM ，e t 丑上R o l eo fC C R 5 ，C C R 2a n dS D F Ig e n ep o l y m o r p h i s m si nap o p u l a t i o no fH I V 一1i n f e c t e di n d i v i d u a l s JB i o lR 8 9 1 dH o m e o s tA g e n t s 2 0 0 1J u l - S e p ；1 5 ( 3 ) ：2 6 5 7 1 6S t r i z k iJ M ，T u r n e rJ D ，C o l l m a nR G e t8 1 Am o l l o B l o l l s la n t i l x x t y ( 1 2 G 5 ) d i r e c t e da g a l T I s tC X C R - 4i n h i b i t si n f e c t i o nw i t ht h ed u a l t r o p i ch u m a ni m m u n o d e f i c i e n e yv i r u st y p e1i s o l a t eH I V - l ( 8 9 6 ) b u tn o tt h eT - t r o p i ci s o l a t eH I V i ( B ) JV i r 0 1 1 9 9 7J u l ；7 1 ( 7 ) ：5 6 7 8 8 37H u b s m a nM Y u d k o v s k yG ，A r o n h e i mA An o v e la p p r o a c hf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o nw i t hi n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i n s 叨N u c l e i cA c i d sR e s 2 0 0 1 ；2 9 ( 4 ) ：E 1 88罗雯徐志凯，阎岩等汉滩病毒M 、S 基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达U 】缅艏与分子免疫学杂志2 0 0 1 ；1 7 ( 2 ) ：1 1 5 - 1 1 79A r o n h e i m AI m p r o v e de f f i c i e n c y8 0 sr e c r u i t m e n ts y s t e m ：e x p r e s s i o no f t h e m a m m a l i a n G A Pr e d u c e s i s o l a t i o no f R a s G T P a s ef a l s ep o s i t i v e s 叨N u c l e i cA c i d sR e s 1 9 9 7 ；2 5 ( 1 6 ) ：3 3 7 3 3 3 7 4 S A R S C o V 抗原在大肠杆菌的表达和抗原性鉴定赵平秦照玲柯垒山任浩赵兰娟高军戚中田( g s _ 军医大学微生物学教研室上海2 0 0 4 3 3 )为鉴定S A P , S C o V 蛋白的抗原性，为建立S A R S C o V 感染的血清学诊断方法提供依据，用大肠杆菌表达系统分别表达了S A R S c “的结构蛋白S 、N 、M 、E 和非结构蛋白3 C L ，并用S A R S 恢复期患者血清对重组病毒蛋白的抗原性的进行了W e s t e r n - b l o t 分析。S A R S - C o V 抗原基因由博亚生物工程公司合成，再根据表达载体的多克隆位点和阅读框架的要求，分别合成各抗原基因引物，以合成的基因为模板，扩增相应的抗原基因。编码S 蛋白第1 4 至3 1 4 位氨基酸残基的片段S 3 0 1 的引物为：S A F ：5 - G A A T r C A T G A G T G A C C T r G A C C G G T G C A C C 一3 ；S A R ：5 - G A A T F C T Y A A C C T C G A G T A A C A T C T C C T G AG G G A A C A A C C3 。编码S 蛋白第5 5 7 至8 9 4 位氨基酸残基的片段$ 3 3 8 的引物为：S B F ：5 一G A A T r C A T G G A T I T C A C T G 1 T C C G T T C G A G A T C C - 3 ：S B R ：5 一G A A T T C G C G G C C G C T r A G G T A A C T- 9 6 C C A A T G C C A T T G A A C C 一3 。编码S 蛋白第8 6 7 至1 1 9 0 位氨基酸残基的片段$ 3 2 4 的引物为：S C F ：5 一G A A r r C A T G G G A T G G A C A T 丌G G T G C T G G C G C T G 一3 ；S C R ：5 一G A A T Y C G C G G C C G C “ A T r G C T C A T A 唧c C C A A T T C 订G - 3 ；N 基因的引物为：N F ：5 一G A A T r C A C C A T G T C T G A T A A T G G A C C C C A A T C 一3 ；N R ：5 一G A A T T C T G C A G C G G C C G C T T A T G C C T G A G T r G A A T C A G C A G 一3 ；编码M 蛋白羧基末端第1 0 1 位氨基酸至2 2 1 氨基酸残基的片断M 1 2 1 的引物为：M B F ：5 - G A A T r C A T G C T C 明T G C T C G TA C C C 一3 ；M B R ：5 - G A A T Y C T Y A A C C T C G A G T C T G T A C T A G C A A A G C 一3 ；E 基因的引物为：E F ： 5 - G A A T r C A l 、四A C 7 r c A r r r c G ，唧G G 一3 ；E R ：5 一G A A T T C G C G G C C G C 7 I r A G A C C A G A A G A T C A C G3 ；3 C L 基因的引物为：3 C L F ：5 - G A A T I E A T G A G T G G T r I T A G G A A A A T G G C3 ；3 C L R ：5 - G A A T r C T Y A A CC T C G A G T T r C G A A G G T AA C A C C A G A G C 一3 。用合成的基因为模板，用P f u D N A 聚合酶( S a n g o n ) 分别P C R 扩增各基因片段，P C R 产物用T a q a s e 加T 处理以后，插入p M D - 1 8 T 载体( T a K a R a ) ，经D N A测序鉴定以后，$ 3 0 1 和N 基因分别插人原核表达载体p P R O E XH T a ( L I F ET E C H N O L O G I E S ) ，转化大 肠杆菌D m q 0 6 m MI P T G 诱导抗原表达；其他基因均插入表达G S T 融合蛋白的原核表达载体p G E x - 4 T - 1 ( P H A R M A C I AB I O T E C H ) ，转化大肠杆菌B L 2 1 D E 3 ，l m MI P T G 诱导融合抗原表达。I P T G诱导前后的大肠杆菌样品分别进行S D S P A G E ，结果见图l - 3 ，表明，$ 3 0 1 ( 结果未示) 、$ 3 3 8 、$ 3 2 4 、N 、E 、M 1 2 1 ( 结果未示) 和3 C L 均得到表达，分子量与预计相符，其中N 表达产物为两条带，分子量较小条带可能为降解产物。再用两份抗S A I L SC o VI g G 阳性混合血清( 经北京华大吉利比爱生物技术有限公司的E L I S A 诊断试剂检测尉各表达产物的抗原性进行W e s t e r n - b l o t 鉴定，S A R SC o V k G阳性血清1 ：2 0 0 稀释，H R P 一山羊抗人I s G ( 华美生物工程有限公司) 以1 ：1 0 0 稀释，D A B ( S i g m a ) 星色。根据显色的速度可以初步认为：N 抗原的抗原性最强( 小分子量的条带也具有抗原性) ，$ 3 0 1 、$ 3 3 8 也具有抗原性，M 1 2 1 和E 的抗原性较弱，$ 3 2 4 和3 C L 未见