KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/供心缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡供心缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡作者：张晓慎,吴若彬 作者单位：广东省心血管病研究所心外科， 广东 广州 510080【摘要】 【目的】 研究供心长时间低温保存后缺血再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡，明确抗调亡因子在心脏移植供心缺血再灌注损伤中的保护作用，为心脏保护液药物研究提供帮助。 【方法】24 只实验 SD 大鼠分 2 组，建立大鼠心脏异位移植模型，在围手术期、供心保存过程中使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3 抑制剂(Ac-DEVD-CHO)干预，使用 HTK 保存液低温保存供心 9 h，监测模型前后，检测凋亡相关因子和病理学指标。 【结果】 在异位移植开放后 60 min，实验组的心率恢复率(71.9 6.9)%高于对照组(59.6 10.5)%;P 0.05。实验组的心肌 Caspase-3 活性(0.695 0.040)低于对照组(3.438 0.035;P 0.01)。实验组的心肌梗死面积(5.29 2.33)低于对照组(22.10 3.00;P 0.01)。实验组的凋亡指数(5.09 2.31)低于对照组(13.4 2.5;P 0.01)。心肌组织 HE染色：对照组的心肌组织损伤较实验组严重。 【结论】 供心长时间低温保存再灌注后细胞出现明显凋亡，心肌细胞凋亡是心脏移植供心长时间保存缺血再灌注后心功能下降的主要机制之一。使用半胱天冬酶抑制剂能明显抑制心肌细胞凋亡，减轻供心缺血再灌注损伤，改善供心心功能，是提高供心保存时效的良好方法。半胱天冬酶抑制剂 Ac-DEVD-CHO 对供心保存的时-效和量-效关系仍KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/有待进一步探讨。【关键词】 凋亡,供心,缺血-再灌注损伤Abstract： 【Objective】 To study the apoptosis after long time of heart preservation， and the barrier of caspase (Ac-DEVD-CHO) in prolonged heart transplantation. To improve the techniques on the preservation of donor heart. 【Methods】 Donor rat hearts were subjected to group A (non-Ac-DEVD-CHO-treated)， group B (Ac-DEVD-CHO-treated) of hypothermic storage， after 9 hours of heart preservation， then performed heterotopic heart transplantation， followed by 60 min of normothermic reperfusion (n = 6 in each group). 【Results】 After 60 min reperfusion， compared with group A， a significant improvement in the percent recovery of HR was observed in group B (P 0.05); Caspase-3 activity was decreased in group B (P 0.01); an apparent decline in the expression of infarct area was observed in group B (P 0.01); an apparent decline in the expression of TUNEL-positive cardiomyocyte was observed in group B (P 0.01); Group B shows the least disease. 【Conclusion】 After preservation and reperfusion， cardiomyocyte apoptosis was observe evidently， which led to irreversible heart dysfunction. The administration of caspase-3 inhibition after reperfusion attenuates ischemia-reperfusion injury by suppressing apoptosis in heart transplantation. Furthermore， the use of caspase inhibition was KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/investigated as a strategy for the preservation donor heart in transplantation. The relationship of dose-response and time-effect is still unknown.Key words： apoptosis; donor heart; ischemie-reprefusion injury心脏移植现在已是治疗终末期心脏衰竭的一种有效手段。但它的应用受到供心的保护和术后心脏功能的恢复的限制。供心保护的不完善所造成的心肌缺血-再灌注损伤是造成心脏移植早期功能衰竭的主要原因。因此，心脏移植时减少心肌缺血-再灌注损伤是提高心脏移植成功率的主要策略之一。对于供心的保护，目前主要是采用 4 的含钾停搏液进行冠状动脉灌注及供心保存，但是临床安全保存时限局限在 4 6 h。如何提高保存时效是目前研究的热点。研究表明，目前对供心脏的保护研究在减少氧耗和能耗、减少氧自由基生成、稳定细胞膜和防止细胞及组织间隙水肿、减少 Ca2+内流、抑制白细胞、血小板聚集及内皮细胞功能的保护方面取得了一定的成果，发明了一批有代表性的保护液应用于临床1。而细胞的凋亡、坏死对于在常温和低温条件下的心肌缺血-再灌注损伤所起的作用日益受到重视。研究表明细胞凋亡是心脏缺血-再灌注损伤的早期事件。缺血-再灌注损伤过程中出现的心肌及血管内皮细胞的凋亡，最终造成了心肌功能的损害及微血管的损伤，是导致非特异性移植物衰竭、移植物失功能、排斥反应和移植后冠状血管病变的重要原因2-5。细胞凋亡的一个关键性因子是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/(Caspase，半胱天冬酶)。Caspase-3 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者。基因剔除实验和动物模型显示，阻断 Caspase 活性即阻滞了体外和体内的细胞凋亡6。在大鼠动物模型，对急性缺血再灌注后的心肌进行免疫组化分析，心肌细胞的 caspase-3 水平明显升高，同时 TUNEL 染色显示心肌细胞 DNA损伤增加7-8。Ac-DEVD-CHO 为不可逆特异性 Caspase-3 抑制剂，能够在细胞水平抑制细胞凋亡蛋白酶级联反应关键性因子 Caspase-3的活性，由此抑制细胞凋亡而达到减少心肌缺血-再灌注损伤。本实验在供心长时间保存过程中及围手术期使用 Ac-DEVD-CHO 干预，探讨在供心长时间低温保存后缺血再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡，明确半胱天冬酶抑制剂能否在低温下进一步延长供心有效保存时效，减少细胞凋亡，提高对心脏缺血-再灌注损伤的保护作用。1 材料与方法1.1 实验动物健康实验 SD 雄性大鼠 24 只，体质量(350 15.7) g，由中山大学实验动物中心提供。随机分为两组：实验组、对照组各 12只，每组供体鼠和受体鼠各 6 只，建立异位心脏移植模型，对照组试剂：40%DMSO + PBS，实验组试剂：40%DMSO + PBS + Ac-DEVD-CHO (0.4 mg/mL)。1.2 主要试剂及仪器HTK 心肌保存液及 Caspase-3 Inhibitor Ac-DEVD-CHO 分别购于德国克勒化学制药和德国 BD Pharmingen 公司。Caspase-3 分光KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/光度法检测试剂盒和 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒均购于南京凯基生物科技发展有限公司。TTC 染色试剂购于 Sigma 公司。全自动微粒子化学发光免疫分析仪(Beckman Coulter，USA)，生化培养箱(广州医疗器械厂)， 显微镜(日本 OLYMPUS 公司)，生物信号采集处理系统(北京微信斯达科技发展有限责任公司)， 手术显微镜(上海医用光学仪器厂)。1.3 实验方法术前 15 min 实验鼠予氯胺酮(150 mg/kg)和安定(3 mg/kg )腹腔内注射麻醉，称重，经尾部静脉注射试剂 0.4 mL，腹腔内注射肝素钠 200 U。接 Pclab 生物信号采集处理系统，持续记录心电图。由剑突沿双侧季肋剪开腹腔，剪开膈肌，由剑突两侧分别向双腋下剪开胸廓，快速摘取心脏、肺及周围组织，放于 4 含 0.4%肝素钠的生理盐水，用手指轻轻挤压心肺，使心肺内剩余血液排出，然后修剪游离升主动脉并横断主动脉，进行主动脉插管。使用 4 HTK液 6 mL 灌注心脏使之停跳(灌注压 60 70 mmHg)，横断肺动脉，用 0 号丝线经横窦、上下腔静脉、肺静脉根部远端结扎。使用 4 HTK 保存液 5 mL + 试剂 0.25 mL 灌洗冠脉(灌注压 60 70 mmHg)，距主动脉根部 5 mm 处横断主动脉，将心脏置入 4 HTK 保存液 6 mL + 试剂 0.5 mL，保存 9 h。 受体鼠术前 15 min 实验鼠予氯胺酮(150 mg/kg)和安定(3 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，称重，腹腔内注射肝素钠 200 U。受体鼠采用腹腔异位心脏移植术9-10：消毒腹部皮肤，正KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/中开腹，显露肾动静脉水平以下的腹主动脉和下腔静脉，结扎其间的血管分支。先后阻断尾、头侧大血管，显微镜下进行供心移植：先做升主动脉-腹主动脉端侧吻合，后行肺动脉-下腔静脉端侧吻合。在供心心尖、受体鼠腹壁分别用 9-0 无损伤缝线固定心外膜起搏导线两条接 Pclab 生物信号采集处理系统，持续记录复跳后供心心电图。血管吻合完成前 10 min 经尾部静脉注射试剂 0.4 mL，开放阻断。术后 60 min 切下供心，快速冷冻 5 min，距心尖 6 7 mm 冠状面横切心脏，切取 1 mm 薄片行心肌 TTC 染色、下段标本置于 40 mol/L 甲醛液体中固定，并常规组织学处理、石蜡包埋后切片行TUNEL 染色、HE 染色;上段标本放在-80 冰箱内冰冻保存检测心肌 Caspase-3 活性。1.4 统计分析本实验结果均采用均数 标准差(x s)表示，采用 SAS for Windows 8.0 社会科学统计软件包处理数据，采用重复测量资料的方差分析进行组内比较和组间交差比较，采用单因素方差分析和LSD-t 进行组间比较。以 P 0.05 为有统计学差异的标准。2 结 果2.1 心率恢复率变化本实验共完成异位心脏移植模型 12 例。各组在恢复灌注后均自动复跳，为窦性心率。在恢复灌注复跳后 60 min，实验组心率(71.9 6.9)%恢复率高于对照组(59.6 10.5)%，(P