厦门大学硕士学位论文在重组大肠杆菌和盘基网柄菌中高效表达可溶性人类Fas配体姓名：罗臻申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：卢英华20090601摘要摘要人类F a s 配体( h F a S L ) 是一种细胞凋亡因子，属于肿瘤坏死因子家族，是死亡蛋白F a s 的天然受体。它是一种I I 型跨膜糖蛋白，通过与细胞表面的F a s 受体结合可引起F a s 表达阳性的细胞凋亡。由于可以诱导肿瘤细胞凋亡，h F a s L 在肿瘤、A I D S 、感染性疾病等的治疗中有着广阔的应用前景。本文分别在原核表达系统大肠杆菌和真核表达系统盘基网柄菌中以可溶性形式实现了h F a s L 的高水平表达。从重组盘基网柄菌A X 3 p L u 8 中提取重组质粒p M B 7 4 h F a s L 作为模板，P C R 成功扩增编码h F a s L 胞外区第1 4 1 2 8 1 个氨基酸的基因序列。选用质粒p E T 3 2 a ( + ) 作为原核表达载体( 其上的T r x A 融合标签可以改善重组蛋白的可溶性) ，将h F a s L 基因插入质粒p E T 3 2 a ( + ) 的多克隆位点，转化大肠杆菌，成功构建了重组表达菌株Ec o l iB L 2 1 ( D E 3 ) p E T 3 2 a - h F a s L 。测序结果表明，插入的目的目的基因大小为4 3 8 b p ，经序列比对发现此片段与人类F a s 配体序列的同源性为1 0 0 ，最终证明重组菌株Ec o l iB L 2 1 ( D E 3 ) p E T 3 2 a h F a s L 构建成功。将此重组菌株接种至L B 培养基，使用I P T G 作为诱导剂，通过考察诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间等因素，获得最适诱导条件，在此条件下h F a s L 表达量可达1 0 m g L 。采用1 0L 发酵罐，选用全合成培养基S I H 发酵培养盘基网柄菌A X 3 F H 。间歇培养至8 0h ，菌体密度最大可达8 3 x 1 0 7 m l ，h F a s L 最高产量为4 2 0g gL 。采用亲和层析( N i N T A ) 纯化重组大肠杆菌和重组盘基网柄菌表达的h F a s L ，经鉴定，目标蛋白纯度分别为9 4 和9 0 。采用M 1 v r 法检测两种不同来源的重组h F a s L体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性，首先通过考察接种细胞数量、M T T 添加量和反应时间等因素，确定M T T 反应的最适条件。在此条件下，两种重组h F a s L 对人宫颈癌细胞和人肺癌细胞的增殖抑制作用上有着相似的生物学活性，并且都呈现类似的剂量依赖关系。关键字：人类F a s 配体；大肠杆菌；盘基网柄菌；亲和层析；凋亡活性A b s t r a c tH u m a nF a sl i g a n d ( h F a s L ) i sac e l la p o p t o s i sf a c t o rb e l o n g i n gt ot h et u m o rn e c r o s i sf a c t o r ( T N F ) f a m i l y I ti sat y p eI Im e m b r a n ep r o t e i nt h a ti n d u c e sa p o p t o s i si nt h eF a s b e a r i n gc e i l s A c c o r d i n gt oi t ss p e c i a lb i o l o g i c a la c t i v i t y , h F a s Lh a st h ep o t e n t i a lt h e r a p e u t i cu s ea sa l la n t i c a n c e ra g e n td i r e c t i n ga te n h a n c i n ga p o p t o s i si nt u m o rc e l l s I nt h i ss t u d yEc o l ia n de u k a r y o t i cD i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mw e r eu s e dt op r o d u c eas o l u b l ef o r mo fh F a s Li nl a r g ea m o u n t A ne x p r e s s i o nv e c t o rf o rh F a s Lp r o d u c t i o ni nEc o l iw a sc o n s t r u c t e db a s e do np l a s m i dp E T 3 2 a ( + ) ，w h o s eT r x AT a gi m p r o v et h er e c o m b i n a n tp r o t e i nt ob ee x p r e s s e di nt h es o l u b l ef o r m D N Ae n c o d i n gt h ee x t r a c e l l u l a rr e g i o no fh u m a nF a sl i g a n d ( a m i n oa c i d s141 - 2 81 ) W a sP C R - a m p l i f i e df r o mp l a s m i dp M B 7 4 一h F a s La n dc l o n e di n t op E T 3 2 a ( + ) T h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp E T 3 2 a - h F a s Lw a st h e nt r a n s f o r m e di n t oEc o l iB L 21 ( D E 3 ) f o rp r o t e i ne x p r e s s i o na n dc h e c k e dt h r o u g hD N As e q u e n c i n g T h es e q u e n c i n gr e s u l ts h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp E T 3 2 a h F a s LW a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d T h ec l o n eEc o l iB L 21 ( D E 3 ) h a r b o r i n gt h ep E T 3 2 a - h F a s LW a sc u l t u r e di ns h a k ef l a s k su s i n gL Bm e d i u mt ov e r i f yt h ep r o t e i ne x p r e s s i o n T h ei n d u c i n gc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e di n c l u d i n gi n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o no fI P T Ga n di n d u c i n gt i m e ，a n du n d e rt h eb e s tc o n d i t i o nah F a s Lc o n c e n t r a t i o no f1 0m gL W a sr e a c h e d D d i s c o i d e u ms t a i n 心0 3 F HW a sc u l t u r e di nac o n v e n t i o n a ls t i r r e db i o r e a c t o ro ns y n t h e t i cS I Hm e d i u m ，a n dc e l ld e n s i t i e so fu pt o8 3 10 7m L “ 1a n dam a x i m u mh F a s Lc o n c e n t r a t i o no f4 2 0l a gL 。1w e r eo b t a i n e da f t e r8 0h o u r so fc u l t i v a t i o n U s i n gN i - N T Aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o n , t w ok i n d so fr e c o m b i n a n th F a s L sf r o mEc o l ia n dDd i s c o i d e u mw e r ep u r i f i e d 埘t l lap u r i t yo f9 4 a n d9 0 ，r e s p e c t i v e l y T h ee y t o t o x i ea c t i v i t i e so fr e c o m b i n a n th F a s L sw e r ed e t e r m i n e db yM T Tm e t h o d M T Tr e a c t i o nc o n d i t i o n si n c l u d i n gc e l ld e n s i t y , c o n c e n t r a t i o no fM T Tr e a g e n ta n dM T Tr e a c t i o nt i m ew e r eo p t i m i z e d U n d e rt h eb e s tM T Tr e a c t i o nc o n d i t i o n ，t h e s et w ok i n d so fr e c o m b i n a n th F a s L ss h o w e ds i m i l a rb i o l o g i c a la c t i v i t i e si ni n d u c i n ga p o p t o s i si nP u l m o n a r yC a r c i n o m a ( A 5 4 9 ) a n dC e r v i c a lC a r c i n o m a ( H e l a ) c e l l s K e yw o r d s ：H u m a nF a sl i g a n d ；E s c h e r i c h i ac o l i ；D i c t y o s t e H u md i s c o i d e u m ；A f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ；C y t o t o x i ca c t i v i t yI I I厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范( 试行) 。另外，该学位论文为() 课题( 组)的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。)厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根