2 3 ( 增刊) ，2 0 0 32 5m e t h o dw i t hh i g hr e s o l u t i o no ft h ed i s s o l u t i o nt e s t i n g T h ei n t e g r a t i o no ff l o wi n j e c t i o nm a yp r o v i d ean e wt o o lf o rp h a r m a c e u t i c a lr e s e a r c hw o r ka n dq u a l i t yc o n t r o lo fd r u gf o r m u l a t i o n s A c k n o w l e d g e m e n t T h i sw o r ki ss u p p o r t e db yt h eP u b l i cS e c u r i t yA d m i n i s t r a t i o no fC h i n a ( 2 0 0 2 612 4 0 01 ) 喜树色谱指纹图谱的研究+吴少平索志荣郑建斌( 西北大学分析科学研究所西安7 1 0 0 6 9 )喜树碱( C a m p t o t h e c i n ，简称C P T ) 是喜树中所含的一种生物碱，具有显著的抗癌活性，是迄今为止发现 的唯一专门通过抑制拓扑异构酶I 发挥细胞毒性的天然植物活性成分。目前已有T P T 、C P T I I 等喜树碱类药物获得美国F D A 批准用于临床治疗癌症，另外尚有数种正在进行临床实验【3 J 。该文研究了不同产地喜树 种子的液相色谱指纹图谱，同时建立了R P H P L C 梯度洗脱分析方法测定喜树碱的含量。 1 仪器与试药 带有二极管阵列检测器的H P l l 0 0 高效液相色谱仪( 美国安捷伦公司) ；D L 1 8 0 型超声清洗器( 浙江省象山县石浦天电子仪器厂) ；M i l l i Q G 超纯水制备仪( 美国M i l l i p o r e 公司) ；植物试样粉碎机( 河北省振兴电器 厂) 。喜树碱对照品购自S i g m a 公司；甲醇，A R 级( F i s h e rS c i e n t i f i c ) ；喜树种子采自浙江金华、磐安、杭 州，广西，湖南，贵州，西安，江西等8 个不同地区。 2 方法与结果 2 1 色谱条件Z O R B A XS B C 1 8 ( 1 5 0m m 4 6r n l T l ，3 5 肚m ) 色谱柱；流动相：A ：水，B ：甲醇溶液；梯度洗脱程序：0m i n ：A ：B ( 6 0 ：4 0 ) ，3 0m i n ：A B ( 3 0 ：7 0 ) ；流速为1 0m L m i n ；检测波长为2 5 4 3 6 a m ；柱温为2 0 ；进样量为5u L 。 2 2 供试品溶液的制备喜树样品经粉碎、过筛后，准确称取其粉末分别约1 0g ，置于5 0m L 烧杯中，加 入1 0m L 无水甲醇静置过夜，样品分别超声提取3 0m i n 、过滤三次并将所得滤液均置于5 0m L 容量瓶，用无水甲醇定容至刻度。分别取适量上述滤液，用0 4 5l a m 针头过滤器滤过，即得。 2 3 对照品溶液的制备准确称取一定量喜树碱对照品置于5 0m L 量瓶中，加入无水甲醇超声溶解、加热后，用无水甲醇稀释至刻度，振荡均匀，取少量用0 4 5 “m 针头过滤器滤过，即得浓度为0 3 9m g m L 。的对照品溶液。2 4 方法学考察2 4 1 空白实验用无水甲醇溶剂1 0 “L 替代喜树样品进行空白实验，色谱曲线除基线稍有漂移外，无杂质峰干扰。2 4 2 对照实验吸取对照品溶液1 0u L 进行对照试验，喜树碱的出峰时问为：“1 5 3 1m i n 。2 4 3 精密度实验以喜树样品( 7 号样品) 为供试品，连续进样5 次，记录色谱图谱。各色谱峰的相对保留 时间的R S D 小于5 ；单峰面积( 大于或等于1 0 总峰面积) 的色谱峰比值的R S D 小于5 。 2 4 4 稳定性实验以7 号喜树样品为供试品，分别在静置0 ，2 ，4 ，8 和1 6h 后检测色谱图，结果表明： 各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的R S D 均小于5 。 2 4 5 重现性实验取7 号喜树样品5 份，准确称定，按“1 2 ”项方法制备供试品溶液，分别进样，各色谱 峰的相对保留时间的R S D 小于5 ；单峰面积( 大于或等于1 0 总峰面积) 的色谱峰比值的R S D 小于5 ，表明其重复性试验较好。基金项目：国家自然科学基金项H ( 2 0 2 7 5 0 3 0 ) 、教育部科学技术研究重点项E I ( 0 2 1 8 7 ) 、高等学校骨干教师资助计划项H ( G G 一1 5 0 7 1 0 0 6 2 8 7 7 ) Y f l J 陕西 省教育厅专项科研基金资助项 | ( 0 1 J K 0 7 6 )2 6药物分析杂志2 4 6 线性关系考察取1 _ 3 项标准溶液。分别准确量取对照品溶液2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ，1 2 0 “L 依次注入液相色谱仪，记录色谱图并以峰面积对进样量( p g ) 进行线性回归，得到喜树碱的回归方程和相关系数分别为( n = 5 ) ：Y 1 0 = 4 6 4 3 4X 一0 0 0 6 6 ，r = 0 9 9 7 12 4 7 加样回收率实验取已知含量的喜树样品( 7 号样品) 为供试品，精密称定，加入1 3 项配制好的对照 品溶液1 0m L ，用无水甲醇溶液定容到5 0 r a L 量瓶中，滤过，进样，平行5 次，计算回收率为：1 0 1 7 ( R S D = I 1 、。 2 5 样品含量测定取1 至8 号样品溶液和喜树碱对照品溶液，按1 4 项色谱条件测定，以外标法计算样品中喜树碱的含量分别为0 1 2 5 ，0 1 5 5 ，0 1 1 2 ，0 1 8 0 ，0 1 1 9 ，0 1 1 l ，0 1 1 4 ，0 1 6 4 。2 6 喜树色谱指纹图谱的建立图1 金华喜树种子的H P L C 图谱F i g 1H P L Cc h r o m a t o g r a mo fC a m p t o t h e c aa c u m i n a t aD e c a i s n e36 0 0鼍4 0 02 03 0 t m h r 图2 喜树种子的H P L C 图谱叠加图F i g 2M u l t i c h r o m a t o g r a mo fC a m p t o t h e c aa c u m i n a t aD e c a i s n e 图中数字为样品号在上述实验条件下对8 个样品分别进样5 “L ，得到相应的8 幅H P L C 图谱( 见图l 图2 ) 。图2 为喜 树种子的色谱指纹图谱，8 个不同地区的样品共有1 4 个共有峰，其中1 3 号峰为喜树碱；由此可见：不同 产地的喜树样品共有1 4 个共有峰，从其中选择保留时间居中、峰高度适度且为它们所共有的喜树碱色谱峰作为参考峰。按照相对保留值计算公式：Q = t n t ，。( 式中k 为待测峰的绝对保留时间，t ，。为参考峰的绝对保留时间) 进行计算。结果表明，8 个喜树样品的平均相对保留值Q ( 共有峰的峰号) 为：0 0 8 9 ( 1 ) ，0 1 1 1 ( 2 ) ，O 2 2 9 ( 3 ) ，0 2 4 4 ( 4 ) ，0 2 8 7 ( 5 ) ，0 3 4 8 ( 6 ) ，0 3 7 2 ( 7 ) ，0 4 3 3 ( 8 ) ，0 4 6 3 ( 9 ) ，0 6 1 3 ( 1 0 ) ，0 6 6 4 ( 1 1 ) ，0 7 0 5 ( 1 2 ) ，1 o o o ( 1 3 ) ，1 6 3 5 ( 1 4 ) 。 3 讨论研究结果表明：不同产地喜树种子中，喜树碱含量以广西的最高，为0 1 8 0 ；贵州所产喜树种子中 喜树碱含量最低，为0 1 1 1 。这一结果可为喜树碱的提取和选择、培育喜树碱含量高的优势种源提供依据。