首届中国中西部地区色谱掌术交流会2 0 0 6 年8 月不同地区茶叶中绿原酸分布的H P L C 研究周莎耍：楚立应用反相高效藏相色谱法测定不同地区茶叶中绿原酸舍量的方法：考察不同茶叶中绿愿酸含量分布情况色谱柱为G e m i n iC 1 8( 1 5 0x4 6 ，5u _ ) 。漉动相乙腑一O 1 磷酸( 0 1 _ 三乙胺) - 8 ：9 2 ，流速梯度洗脱，柱疆2 4 “ C ，检测波长3 2 3 n m 绿原酸在0 6 2 5pg m l 一4 0 ps t l 的线性关系良好，r 6 5 0 9 7 x + 1 3 4 d 了( r - o 9 9 8 ) 。最低检测限为：0 2 0 4 n g ；方法高、中，低浓度回收宰分别为：9 6 9 5 ，9 9 0 4 _及1 0 2 5 ：高中低浓度重复性精密度( R S D ) 分别为：o 0 2 O 2 4 和o 1 9 本方法准确，快速童现性好，适于大量茶咔样品中绿尿酸含量的测定关键词：茶；绿愿酸；高效液相色谱法：分布茶叶是世界三大饮料( 茶叶，咖啡，可可) 之一，近年来，因其多种保健作用而受到广泛关注。研究表明，饮茶可降低患癌症，心血管疾病的危险，还有抗炎，减肥等作用。茶叶中含有大量植物二级代谢产物，如氨基酸，儿茶素，嘌呤碱，多酚，绿原酸等。其中，绿原酸( 3 O 咖啡酰喹啉酸)是咖啡酸和喹啉酸的缩酚酸l ，具有抗炎2 ，清除自由基3 ，4 ，5 ，抗菌，抗病毒，抗肿瘤，升高白血球，保肝利胆，将血压，降血脂，中枢神经系统兴奋等作用6 。本试验考察了不同品种茶叶中绿原酸的测定方法，并对1 3 种市售常见茶叶中绿原酸含量进行了测定，通过考察不同产地，不同品种茶叶中绿原酸含量；为绿原酸作为茶叶质量评价指标之一提供数据，并为各种茶叶保健作用及其适饮性研究提供参考。1 仪器与试剂1 1 仪器：日本岛津L c 6 A 高压泵，S P D - 1 0 A v p 紫外检测器，S e p u 3 0 0 0 色谱工作站，：S h a n g p i n gF A 2 0 0 4万分之一电子分析天平( 上海天平仪器厂) ，T G L - 1 6 G A n k e 飞鸽牌高速离心机，G L 8 8 B 旋涡振荡器，海门麒麟医用仪器厂，B r a n s o n2 0 0 超声清洗机。( B r a n s o nI _ t L t r a s o n i c sc o r p D a n b u r yC TU S A ) 。1 2 试剂和样品：样品( 均购余成都市百货大楼武侯商场) ：羌山雀舌，四川省绵阳市佛泉茶厂；峨嵋苦丁，四川省峨嵋山；峨嵋银针，四川省峨嵋山；珍珠茶，四川省成都市老茶客有限公司：香茶王毛峰，四川省成都市香茶王茶叶有限公司；江苏碧螺春，江苏省宜兴市新征茶厂；荣莉花茶，四川省峨嵋山竹7 叶青茶叶有限公司；御龙井，杭州御牌茗茶总公司( 特级) 。福建铁观音，福建省安溪县南成茶厂；福建乌龙，福建省安溪县南成茶厂。云南小沱茶，云南省茶厂。祁门红茶，成都市茶叶有限公司。海南苦丁，海南省千年苦丁。对照品：绿原酸( 供含量测定用) ，中国药品生物制品检定所，1 1 0 7 5 3 2 0 0 2 1 2试剂：甲醇，色谱纯，购于F I S H E R 化学试剂公司；乙腈，色谱级，购于F I S H E R 化学试剂公司；超纯水：购于中科院成都分院西南物理研究所。磷酸，三乙胺，无水乙醇等其它化学试剂均为分析纯。2 1 7首届中国中西部地区色谱掌术交流会2 0 0 6 年8 月2 方法和结果： 。2 。1 液相色谱条件和方法适应性试验色谱柱G e m i n iC 1 8 柱( 1 5 0 4 6 ，5 u m ) ，柱温2 4 ，检测波长3 2 3 n m ，流动相：乙腈0 1 磷酸( 0 j l 三乙胺) ( 8 9 2 ) ，进样量1 0 u L ，梯度洗脱见表1 。待测物色谱峰理论踏板数8 1 7 0 ，与前后相邻两峰分离度分别为1 7 、2 3 ，符合含量测定要求。表1 漉动相流速梯度表2 2 标准曲线的制备精密称取绿原酸标准品适量，用5 0 乙醇溶解，制成4 0 ，2 0 ，1 0 ( 图2 ) ，5 ，2 5 ，1 2 5 ，0 6 2 5 u g m L系列浓度标准液，分别取1 0 u L 进样。以峰面积( Y ) 为纵坐标，浓度( X ) 为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程；Y = 6 6 0 9 7 X + 1 3 4 6 3 ，产O 9 9 8 ，线性范围：0 6 2 5 “ - - 4 0 1 a g m l 。检测限：0 2 n g 。结果呈良好线性关系。i2 3 提取方法考察提取溶剂的选择：精密称取茶叶样品5 份于2 5 m L 容量瓶，分别加入水、2 0 乙醇、5 0 乙醇、8 0 乙醇、5 0 甲醇，超声3 0 m i n ，离心5 m i n ，微孔滤膜过滤，取续滤液1 0 u L 进样，比较峰面积大小，结果表明以5 0 乙醇提取效果较好。提取时间的选择：精密称取茶叶样品5 份于2 5 m L 容量瓶，5 0 乙醇定容，分别超声1 0 r n i n ，2 0 m i n ，3 0 m i n ，4 0 r a i n ，及静置6 0 m i n 。离心5 m i n ，微孔滤膜滤过，各取续滤液1 0 u L 进样，比较峰面积大小，结果表明超声提取3 0 m i n 提取效果较好。抗氧剂考察：精密称取茶叶样品3 份于2 5 m L 容量瓶，分别加入0 1 硫代硫酸钠，0 1 亚硫酸氢钠，5 0 乙醇，超声3 0 m i n ，离心过滤，取续滤液1 0 u L 进样，用t 检验考察各峰面积，称样量值，结果无显著性差异。2 4 重复性试验精密称取高、中、低浓度样品各3 份，按2 7 项下操作，测定绿原酸含量，计算R S D 分别为0 0 2 、0 2 4 及0 1 9 。结果见表2 。襄2 重复性试验结2 5 加样回收试验：以碧螺春为试验对象，精密称取己知含量样品1 0 9 9 份，每3 份分别精密加入对照品1 0 ，2 0 ，3 O r a l ，得高、中、低浓度样品各3 份，按2 7 项下操作，测定绿原酸含量，计算回收率平均值分别为9 6 9 5 ，9 9 0 4 及1 0 2 5 。结果见表3 。2 1 8首届中国中西部地区色谱学术交流会2 0 0 6 年8 月2 6 稳定性试验：以珍珠茶为试验对象，按2 7 项下操作，分别于0 ，0 5 ，2 ，5 ，9 ，2 4 h 进样，测定峰面积，峰面积平均值为9 7 2 8 8 2 ，R S D 为4 1 8 ，结果表明，该方法所得样品溶液中绿原酸峰面积在2 4 h 内稳定，适于大量茶样的测定。结果见表4 。表4 稳定性试验结果2 7 样品测定精密称取各种茶叶样品粉末约2 9 于2 5 m L 容量瓶，5 0 7 , 醇定容，摇匀，超声3 0 m i n ，5 0 0 0 r a d m i n离心5 m i n ，微孔滤膜滤过，取续滤液l O u L 进样，按外标一点法计算各样品含量，结果见表5 。袭5 不同品种茶叶中绿原酸含量测定，= 33 讨论3 1考查了样品在水，2 0 乙醇，5 0 乙醇，8 0 乙醇，5 0 甲醇中的提取率，其中5 0 乙醇提取率较高，且稳定，本实验中选择5 0 7 , 醇为提取溶剂；考查不同超声提取时间对样品中绿原酸含量的影响，其中提取3 0 r a i n 较l O m i n 、2 0 m i n 高，提取4 0 r a i n 较3 0 m i n 提取率无明显提高，故本试验中选择3 0 m i n 为提取时间。因绿原酸为多酚类化合物，并且结构中含有双键，易被氧化，考查加入抗氧化剂对提取率的影响，于2 4 h 内，对样品提取率无明显改善，故本试验提取方法中不加入抗氧化剂。3 2 考查流动相中有机溶剂比例对绿原酸色谱峰的影响，其中乙腈比例为8 时，保留时间适宜，2 1 9首届中国中西部地区色谱掌术交流会2 0 0 6 年8 月并有较好分离度和柱效。柱温对绿原酸及其相邻峰分离度有较大影响，柱温2 4 “ C ，流速0 7 m l m i n时，各茶叶样品中绿原酸及其相邻峰均能达到基线分离有较高理论踏板数；为提高分析速率缩短分析时间以便于大量样品的测定，在迸样后2 5 m i n ，即绿原酸出峰完全后，将流速提高至1 4 m L m i n ，将色谱柱中残留组分冲出。3 3 红茶，黑茶等半发酵，发酵茶中绿原酸含量较低，可能加工工艺对其含量稳定性有一定影响，尤其是温度，生物酶的影响。可进一步考察各加工步骤对其含量的影响，以优化工艺，提高茶叶饮用价值。3 4 苦丁茶中绿原酸含量较高，而苦丁茶为大青叶的加工制品，提示大青可作为绿原酸植物提起的来源之一。 0参考文献1 、F i s c h e r H O L a n d I ) a n g s c h a t O j 【o n s t i t u t i o n d e r C h l o r o g e n 摹茜u 他( 3 M i 讹i l u b e r C h i n 酗三u 佗u n d D e r v a t e ) B e r i c h t e 6 5 ：1 0 3 7 - 1 0 4 0 ( 1 9 3 2 ) 2 D S D u a n e ，M E D o | a b c l a ，c E S a l a s D S R a 3 蛔A B O l i v e i r 勰, A N c n m i n g 嚣I B 晰e d l 棚帆H W a g n e r ，J L o m b a r d i M T L o p e s ，J P I l 丑珊P h am a c o i 5 2 ( 2 0 0 0 ) 3 4 7 - 3 5 2 3 S J L e e , K H S o n , H W C h a n g , S S K a n g , H R K i m ，P h y t o t h e r , R e s 1 2 ( 1 9 9 s ) 4 4 5 4 4 7 4 T T s u c h i y a , 0 S u z u k i , K I g a r a s h i 。B i m c i B i o 慨l m o ! B i o c h e m 6 0 0 9 9 1 6 ) 7 6 5 7 6 8 5 T S a w a , M N a k e o , T A k a i k e ，K 0 l l o ，H M B e d a J A g r i c F o o dC h e m 4 7 ( 1 9 9 9 ) 3 9 7 - 4 0 2 6 刘军海，袭爱泳，绿原酸及其提取纯化和应用前景叽粮食与油脂，2 0 0 3 ( 9 ) 4 4 4 6