中国协和医科大学硕士学位论文心肌细胞生理特性的探讨姓名：王程申请学位级别：硕士专业：病理生理学指导教师：修瑞娟20030601中田医学科学院中田协和医科大学硕士学位论文正当紧张地宪成我的毕业论文的时候，一场人类历史上的灾难，S A R S ，突然侵袭了伟大的首都- 北京。我所认识的许多老师、同掌和朋友备不顾身地投入到与S A R S抗争的战斗中。作为一个科研人员的我时刻关注这场战斗的进展并正在导师修瑞娟教授的启袅下，准备亲身投入对S A R S 戋病机制深入探讨的战争中去。我的导师修瑞娟教授在6 0 年代对暴喾性、流行性脑用炎的斗争经验给了我很多启示。在紧急抢救患儿时。她应用白装的仪器时患者进行了连续2 4 小时、不间断的微循环观察后。在人体内发现了微血管自律运动自0 变化在疾病裳生、鬟展中的作用并积极参与了对患J L 的抢救。S A R S ，作为一种新的、严l 危害人民身体健康的疾病，人们对其知之甚少：其裳生、发展的速度令人吃惊。然而，毫元疑问的是，它同其它的传染病一样如流行性脑膜炎进入人体后必然会3 I 起人体正常生理活动的紊乱及某些器官功能的失调。因此如果找们能够利用已有的各种技术并不断学习新的技术深入发现它们的致病机制，并以此为突破口，来制止和修复S A R S 病毒对人体功能的损伤，战胜S A R S将会很快实现。论文完成之际就是弛投入新的战斗的时刘。前辈们献身科研的精神激动我、他们与疾病作斗争的宝贵经验鼓励P 我我一定要利用我所掌攫的医学知识及各种技术方法为武器以研究和裳现疾病的本质并战胜疾病作为我终生的追求和职责。我相信，只要我们医学工作者牢牢地掌握科掌知识，学习前辈们的奉献精神，便有本领使危害人类健康的疾病在地球上消失!中置医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文摘要心肌细胞生理特性的探讨心脏主要是由心肌细胞、间质细胞和微血管组成，它是维持人体生命活动正常进行的主要器官之一。心血管系统疾病与人类的关系十分密切，心肌缺血再灌注等类型的损伤在临床上很常见。由于受到血流动力学、激素、神经反射的影响，在体的心肌损伤模型并不能准确反映某些因子或因素在心肌损伤中的作用，进而影响到该类疾病研究数据的准确性和可靠性。目前的大量实验证明，体外培养的心肌细胞可以作为一种有效的模型，来替代在体心脏进行实验研究。而对心肌细胞的生理特性进行研究，就会为研究病理状态下心肌细胞的各种表现提供理论基础。在本实验中，我们主要研究以下两方面的内容：1 、初步探讨成纤维细胞影响心肌细胞搏动频率的机制；2 、探讨各部位心肌细胞药物预适应的能力及一氧化氮在其中的作用。一、成纤维细胞影响心肌细胞搏动频率的机制方法：培养不同浓度( O 5 1 0 5 e e l l s m L 、1 0 X 】0 S e e l l s m L 、1 ，5X1 0 5 e e l l s , m L 、2 O 1 0 5 c e l l s m L ) 心肌细胞和成纤维细胞，分别在培养的第二、三、四天，观察心肌细胞的搏动频率。同时将培养的心肌细胞分别用不同浓度的成纤维细胞培养液( 8 0，5 0 ，2 0 ) 和不同时间间隔的成纤维细胞培养液( 第二天、第四天、第六天)进行处理，在培养的第二、三、四天观察心肌细胞的搏动频率。最后采用内皮素受体阻断剂B Q l 2 3 ( 1 0 X1 0 。6 m m 0 1 L ) 处理心肌细胞，观察并分析内皮素能否影响细胞的搏动频率。结果：心肌细胞单独培养时，其浓度越大，培养时间越长，搏动频率越高。低浓度组( n = 1 5 ) 的搏动频率在9 6 h 达高峰，为8 8 9 5 。8 次分，高浓度组( n - 1 5 ) 的搏动频率在9 6 h 达高峰，为1 4 4 2 6 2 次分，两者之间有显著性差异( P o 0 5 ) 。给予缺氧预适应作用后，细胞损伤的各种指标均显著下降( P 0 0 5 ) A f t e rh y p o x i ap r e c o n d i t i o n i n ga n dL - a r g i n i n ep r e c o n d i t i o n i n g t h e s ei n d e x e sw i l ld e c r e a s e ( P 用0 2 5 的胰擞自酶消化细胞1 分钟，加入邋藿含1 0 胎牛血清的培养液反复吹打至细胞脱壁。2 )用1 5 m L a p p e n d e r f t u b e 敬1 0 6 个待测细胞，寰温- 1 5 0 0 转，分离心5 分钝收集缀貔。3 )用c e l lw a s h i n gb u f f e r 洗细胞两次，每次1 分钟离心条件同上，收集缓麓。4 )吸除c e l lw a s h i n gb u f f e r 。5 )翔入1 0 0 p L c e l lIs i s b u f f e r 爨及6 1 1 Ll O m g m L 蛋白激酶K ，搅拌混匀，5 0 保温，不时搅拌至溶液变清亮。6 )加入等薅积的e x t r a c t i o nb u f f e rI 抽提，遗和镬转混匀1 0 分耱，室潼t1 0 0 0 0 转分离心5 分钟。7 )将上屡本鞠转移至薪数1 5 m L e p p e n d o r f t u b e 中，加入等体积e x t r a c t i o nb u f f e r I t 抽提。温和倒转混匀1 0 分钟，室温。1 0 0 0 0 转分离心5 分钟。8 )小心吸取上层水相，加入1 1 1 0 体积的3 N 酶N a A c 及2 倍体积的乙醇，混匀。9 )将此悬液在- - 2 0 沉淀2 小时。1 0 ) 在4 “ C ，1 2 5 0 0 转分离心细胞悬液2 0 分钟，去上清。1 1 ) 用l m L7 0 乙醇洗细胞一遍。1 2 ) 将沉淀晾干或囊空抽干蘑溶于2 0 1 s LT Eb u f f e r 2 0 a g m LR n a s eA 中，5 0 e 保温1 小时。1 3 ) 将沉淀转入6 8 “ C 保温l O 分钟，再放入球土2 分钟。加入4 a L6 l o a d i n gb u 腧r 混匀。1 4 ) 在含5 0 t g m L 溴化乙凌豹1 5 A g 甜o s e 上，恒漉5 0 1 0 0 m A 毫泳1 2小时，于紫外成像仪下观察结果并摄片。中翻版学科学院中闺协和医科人举坝I j 学位论立七、细胞内钙离予浓度的榆溅荧光探针F l u o 3 染色：我们采用的荧光探针F l u o 3 怒桔黄色干燥粉末。分子量为8 5 5 t 用D M S O 溶解为I m m o l 的储存液，低潺冰箱内避光保存。使用前嬲食钙、镁的P B S 稀释戒2 1 a m o l L 的浓度。绷胞经过各种处理瑶，先将培养皿内的培养液移出，用生理盐水反复冲洗两邂。各皿中均加入3 1 t L 的钙掰予染色剂和lm L 的生理盐东。在避光、3 7 条 牟下葳痰l 小对，然后将缩筑麸孵衽串取出，翔生理盐永i 串洗两遍，迅速移至激光拱聚焦显微镜下检测荧光强度。检测时激发光选用4 8 8 n m ，发射光选嗣5 3 0 r i m ，辁灏拜季将载玻靖鋈定在鼗徽镜载携螽主，奁不同匏撬野选择l 以令萃细胞进行造续扫描检测，扫描间隔时阳J 为2 0 秒。所有的图像均存入计算机硬盘中，分辑薅重凝读出。选霜豹图像霹采躅彩惫喷墨拷印辘努露，缨瞧内钙寨子豹浓覆虢缍腿表面结合的荧光强度表示。爻、缎藏蛋鑫激魏e 溪瞧戆检测为检测心肌细胞中蛋白激酶C 的活性强度，我们利用表皮生长因子中的个肽段( A r g - L y s A r T h r - L e u - A r g - A r g - L e u ) 终为激酶豹褒物。这令冀錾辩锈离子辍羧毪移钙离子非依赖性的蛋白激酶C 各个啦型均有很高的特异性，但它对缀白激酶A 的特巽性毙拔低。1 )将备组细胞用0 2 5 的胰蛋白酶j 行消化。2 )矮N a C l 撑i ；孛洗缀爨嚣次。3 )将细胞悬浮于B u f f e r A 溶液中，调节细胞浓度至1 5 1 0 5 孑L 。4 )热入底拯救t 0 0 t M 、镶球菌溶盘索O ( 2 5 0 0 0u n i t s ) 、y 3 2 P - A T P ( 9 c p m p m o l ，f i n a lc o n c e n t r a t i o n2 5 0 肛M ) 。5 )3 7 条棒下孵肖混合液l 舀分镑，耱入2 5 豹三氯乙酸终止反瘟。6 )冰上继续孵霄混合液1 0 分钟。7 )取1 0 0 p L 反斑液，加程离亍：交换联析纸上。中田医学科学院中固坍和医科人学坝l ：学位论义8 )用含3 0 醋酸和1 磷酸的混合液冲洗两次，每次1 0 分钟。9 )9 5 的乙醇冲洗5 分钟。1 0 ) 待层析纸干燥后，将其放入闪烁杯中，加入闪烁液8 m L ，立即上机检测蛋白活性强度。11 ) 对照组采用不含肽底物的样品。1 2 ) 每个样品重复三次，取其平均值作为蛋白激酶C 的活性。九、统计学处理各组数据用均数来表示，进行组问t 检验分析，P 0 0 5 ) 。2 缺氧预适应和药物预适应均能减轻缺氧再复氧造成的细胞损伤( P o 0 5 ) 。展望我们的实验研究发现，药物预适应与缺血缺氧预适应一样，可以对缺血再灌注心肌产生十分明显的保护作用。这种保护作用是由N O 触发的，P K C 在其中起到了关键性的作用。这为硝酸酯类药物在临床上的应用开辟了一条新的途径。以往硝酸酯类药物的用途主要是治疗心绞痛和降低前负荷，现在证实它还可以预防缺血性心肌坏死，并在梗塞发生时减少梗塞的面积。如果我们能够摸索出能最大限度激发这种内源性保护性机制的给药途径和剂量，并逐步将其应用范围从实验室扩大到临床，就能够从理论上对心肌梗塞的高危人群进行预防性治疗，达到防患于未然的效果。单磷脂A就是在预适应理论指导下开发的一种新药，目前已经进入I I 期临床实验1 7 3 】。而其它类型的药物，能缓解缺血再灌注给机体所造成的损伤【，可能也能产生预适应保护作用。我们相信：随着预适应机制的不断阐明，在不久的将来会有更多的预适应药物应用于临床。与此同时，随着对生命活动的认识日渐加深，我们已经确切的认识到蛋白质才是反映细胞内变化的物质，只有在蛋白质水平上才能真正的揭示各种生命现象和疾病的形成，蛋白质组学是医学研究进步的载体和里程碑7 5 1 。而从蛋白质组学的角度对药物预适应过程中起关键作用的P K C 及其它未知的调控蛋白进行研究，就能更加全面的阐述药物预适应的作用机制，这将是我们下一步研究工作的主攻方向。中用医学科学院中周协和医科大学硕士学位论文6 5 参考文献1 N e l lG r a n g e r I s e h e m i a - r e p e r f u s i o n ：m e c h a n i s m so fm i c r o - - v a s c u l a rd y s f u n c t i o na n dt h ei n f l u e n c eo f r i s kf a c t o r sf o rc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e sM i c r o c i r c u l a t i o n 1 9 9 9 ；6 ：1 6 7 1 7 82 D a v i dO W i l l i a m s ，R o g e rBB o a t w r i g h t ，K a r l aSr o s a ，e ta 1 M y o c a r d i a lb l o o df l