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复旦大学博士后学位论文中小血管无缝线胶粘吻合的实验研究姓名:曲乐丰申请学位级别:博士后专业:外科学指导教师:王玉琦20021201中小血管无缝线胶粘吻合的实验研究中文摘要吻合口的狭窄和闭塞是各类中小血管旁路手术后中远期疗效较差的主要原因,而吻合口狭窄和闭塞的主要原因是血管壁的损伤。传统的缝线吻合会导致不可避免的血管壁损伤,为了探索一种对吻合口损伤小、通畅率高且操作简单的吻合方法,本研究以医用胶行兔颈动脉的无缝线胶粘吻合,观察其可行性和疗效。其可行性在于两方面,一是使用医用胶能否完成中小血管的无缝线胶粘吻合,二是此方法吻合的血管能承受多高的血压,即其吻合口爆破压的大小。将兔颈总动脉两断端间隔1 2 0 。缝台3 针并以其作为牵引,在贴合紧密的两衄管壁外膜上涂抹少量医用胶即可完成胶粘吻合,抽除3 针缝线即完成无缝线胶粘吻合。证明其技术是可行的。在此基础上,以自制的血管吻合口爆破压检测装置测定其吻合口爆破压平均值为4 4 0 删g ,远远超出兔的平均动脉压,也远远超出人的病理性高血压。证明此方法是可行的。在可行性基础上,将无缝线胶粘吻合与传统缝线吻合进行对比性研究。结果显示胶粘吻合操作简单,省时省力,其手术时间大大缩短( 8 1 9 6 5 1m i nV S2 0 5 0 1 4 3 5m i n ) ,术中出血量明显减少( 2 4 4 5 8 3m i n 憎1 0 3 8 1 7 4 9m i n ) ,其通畅率也较高( 9 1 7 V S8 3 3 ) ,病理切片观察及图像分析提示其内膜增生程度明显减轻,术后l 、2 、4 、1 2 周时其内膜厚度较缝线组分别降低了3 1 4 ( P 9 5 。C ) ,室温冷却后抗原修复液( 博士德公司) 室温作用1 0 r a i n ,进行抗原修复。( 4 ) 5 羊血清3 7 。c 封闭2 0 m i n 以阻断非特异性结合。( 5 ) 滴加一抗工作液,3 7 。c 孵育6 0 m i n 。( 6 ) 滴加抗一抗种属I g G 生物素标记二抗,3 7 。C 作用3 0 r a i n 。( 使用前与5 币常兔血清4 。C 共孵育3 0 r a i n ,以阻断二抗与兔I g G 的交叉反应) 。( 7 ) 滴加链酶亲和素,3 7 。c 孵育3 0 m i n 。( 8 ) 加D A B 底物液显色:使用D A B 试剂盒。取l m l 双蒸水,加试剂盒中A 、B 、C 试剂各一滴,混匀后加至切片。室温显色,镜F 控制反应时间。蒸馏水洗涤终止反应。( 9 ) 苏木素轻度复染。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。( 1 0 ) 显微镜下观察P C N A 的表达情况。采用计算机图像分析系统测定内膜及- J 膜细胞总数及相应区域P C N A 染色阳性细胞数,计算内膜、中膜增殖细胞阳性率,即为该区域细胞增殖指数( P C N AI n d e x ) 。8 ,T G F 1 3 1 免疫组织化学染色检测取实验组和对照组术后2 周的标本蜡块,切成4 u m 厚切片,以抗T G F 8 1抗体进行s P 法免疫组织化学染色,对比性观察其增生及内皮化相关细胞因子的表达情况。滴加一抗前用O 1 胰蛋白酶( p H 7 8 ) 消化1 5 m i n ,其它步骤同P C N A的免疫组化。9 统计学处理结果以平均值标准差( x s ) 表示,统计分析用t 检验。P O 0 5 ) 。中膜面积两组间无显著差别( P O 0 5 ) 。内膜,中膜面积比值较对照组在术后1周、2 周、4 周及1 2 周时分别降低了3 3 3 ( P 0 0 5量量大学博士后研究I 作报告第三部分附表3 吻合口处内膜,中膜厚度比值比较( X s )T a b 3C o m p a r i s o no fi n t i m a l me d i a lt h i c k n e s sr a t i ob e l we e nC o n t r o la n dS u b j e c tGr o u p sP O 0 5附表6 吻合口处内膜中膜面积比值比较( X s )T a b 6C o m p a r i s o no fi n t i m a l m e d i a la r e ar a t i ob e t w e e nC o n t r o la n dS u b j e c tGr o u p s组别术后1 岗术后2 周术后4 周术后1 2 周对照组o 5 4 O 0 3O 7 2 o 0 310 5 0 0 81 1 0 o 0 2实验组0 3 6 _ + 0 0 10 5 2 1 0 0 30 7 4 0 0 30 6 8 _ + 0 0 4P O 0 5wc O n t O la tl w - 2 w , 4 Wa n d1 2 Wp o s t o p e r a t i v e l y第三部分手术后时间图3 2 0 吻合口处内膜伸膜增生厚度比值比较F i g3 - 2 0C o m p a r i s o no fi n t i m a l m e d i a lt h i c k n e s sr a t i ob e t w e e nC o n t r o la n dS u b j e c tG r o u p sa tl W , 2 w , 4 Wa n d1 2 Wp o s t o p e r a t i v e I yp 0 0 5wC o n t r o l手术后时间图3 2 3 吻合口处内膜中膜面积比值比较F i g3 - 2 3C o m p a r i s o no fi n t i m a F m e d i a la r e a sr a t i ob e t w e e nC o n t r o la n dS u b j e c tG r o u p sa tl w , 2 w , 4 Wa n d1 2 Wp o s t o p e r a t i v e l y尸 ) ,二是后期( 指介入治疗3 0 天后) 血栓形成。若这两个并发症可解决,那么冠脉内放疗在经皮冠状动脉介入术中即可能获得突破性进展1 1 3 j 。综述( 二)( 4 ) 光动力疗法( P h o t o d y n a m i ct h e r a p y ,P D T )系指组织中预存的光敏剂吸收光能后被激发为单线态氧,使细胞发生强烈氧化而被抑制。主要方法有两种:一是传统的激光体外辐射疗法,二是血管腔内激光辐射疗法,后者更适合腔内血管外科的发展,成为研究的热点。此疗法中的研究主要集中在两个方面:一是无毒高效光敏剂的研究,二是均匀辐射的激光光纤和恰当的局部辐射途径的研究。( 二) 肢体缺血性疾病对于不能行常规血管重建的严重缺血肢体,主要治疗方法是促进其新生血管形成( a n g i o g e n e s i s ) ,也就是所谓的“分子搭桥术”。血管内皮生长因子( V a s c u l a rE n d o t h e l i a lG r o w t hF a c t o r V E G F ) 基因是主要的治疗基因,因为V E G F 不仅能刺激内皮细胞分裂增殖形成新的血管,而目堵2 使新生侧支血管具有一氧化氮依赖性血管舒张反应,从而增加侧支循环血流量,另外,V E G F 的蛋白产物能从细胞中分泌出来,产生旁分泌效应 1 ”。将V E G F 基因应用各种载体携载后通过多种方式如直接肌肉注射、基因缝线、基因电针技术等导入缺血肢体均可有效促进侧支血管的形成5 l ,而且V E G F 裸D N A 直接肌肉注射即能有效促进侧支循环的形成H 】。转V E G F 基因治疗肢体缺血疗效确切,在国内p h V E G F l 6 5 已被批准进入临床期研究。V E G F 和F G F 的联合应用能更有效地促进新生血管形成。另外,电磁刺激亦可促进缺血组织新生m 管的形成 I6 1 ,但其确切机制及临床效果尚有待进一步研究。( 三) 血栓形成在血栓形成的防治中主要有两方面的研究,一是新型抗血栓形成药物,如低分子肝素以及新型抗血小板药物G p I I b I I I a 、t i c l o p i d i n e 等m l ;二是基因治疗,主要的候选基因有组织型纤溶酶原激活剂( t P A ) 基因、血管环氧化物酶( c o x 一1 )基因、一氧化氮合成酶( e N O S ) 基因、蜱抗凝肽( T A P ) 基因、血栓调节蛋白( T H M ) 基因、水蛭素基因等。水蛭素基因是近年来研究的热点,它既能直接抑制凝血酶的作用,又能在血管损伤时抑制血管壁内组织因子基因的表达,更有利于在F F A 术后防治附壁血栓形成m 。其基因载体及导入途径同V I H 的基因治疗相类似,目前研究的热点是将抗血栓形成基因与血管内支架联合应用。复星太掌镰士看哿 究I 作摄告综述( 二)( 四) 主动脉瘤1 主动脉瘤的形成机理研究腹主动脉瘤的主要病理变化包括:动脉壁中层弹力纤维的广泛断裂和退化、胶原纤维所占百分比相对过多、免疫及炎性细胞的慢性透壁浸润、免疫球蛋白沉积、中层新生血管形成及中层平滑肌细胞数量减少。多数研究集中在胞外基质方面,如通过弹力蛋白酶局部灌注而形成大鼠腹主动脉瘤模型等,近年来对腹主动脉瘤中V S M C 的研究日益增多1 9 2 0 】。腹主动脉壁中膜V S M C 的铁失对腹主动脉瘤的形成起重要作用,而V S M C 缺失的原因并非通常认为的“坏死”,而是由各种原因诱导产生的V S M C 凋亡,其具体机制尚难以完全阐明。但已有研究表明,腹主动脉瘤壁中V S M C 的凋亡伴随着P 5 3 和P 2 1 蛋白表达明显增多。对腹主动脉瘤中V S M C 缺失的细胞学及分子学机制的深入研究将迸一步阐明动脉瘤的形成过程及其形成中的关键环节,为动脉瘤的防治提供新的思路对于早期动脉瘤是否可通过抑制中膜平滑肌细胞的凋亡而阻抑或延缓其进一步扩张?2 主动脉瘤的治疗及并发症的防治( 1 ) 腔内血管外科的飞速发展使得主动脉瘤的治疗进入了一个崭新的时代,同时也产生了一些新的研究课题和研究领域。内漏( E n d o l e a k ) 及内高压( E n d o t e n s i o n ) 是由此产生的新概念及新课题。1 9 9 6 年W h i t e 2 1 1 给内漏下了较为严格的定义:与腔内血管移植物相关的,在移植物腔外且在被此移植物所治疗的动脉瘤腔及邻近血管腔内出现持续性血流的现象称为内漏。内漏的出现被视为手术不成功的标志,所以内漏的防治成为近来研究的热点。主要方法除了在术中加置e x t e n s i o n 或c u f f 之外,有在瘤腔内置可吸收胶状海绵或注射各种胶或凝血酶使腔内形成血栓的【2 ”,有经后腹膜腔镜结扎相关腰动脉或肠系膜下动脉的。而一些隔绝术后没有内漏发生的动脉瘤瘤腔仍持续扩张或发生破裂,其原因在于瘤腔的内高压主动脉瘤行腔内修补术后瘤腔内仍有持续性或复发性高压的现象 2 “,有内高压存在时动脉瘤仍需进一步处理。所以腹主动脉瘤腔内隔绝术后瘤腔内压力的研究将成为今后研究的热点。( 2 ) 下肢截瘫是胸腹主动脉瘤手术后的严重并发症,其防治的研究成为近年来血管外科研究的热点之。目前认为,脊髓缺血后损伤机制是脊髓的觑供综述( 二)减少致神经元缺血;常温下线粒体氧化磷酸化停【卜3 - 4 r n i n ,三磷酸腺苷( A T P )的储备即耗竭:细胞膜A T P 酶依赖性泵功能衰竭导致细胞内外离子平衡紊乱,细胞内钙蓄积,钙水平增高激活钙依赖性酶,损伤D N A 及结构蚩白【2 “。黄嘌岭氧化酶释放使得脊髓再灌注时,次黄嘌呤氧化形成超氧自由基,内生性氧自由基清除剂
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