D E K 在非小细胞肺癌中的表达及功能研究T h ee x p r e s s i o na n df u n c t i o no fD E Ki nn o n - s m a l lc e l ll u n gC a n c e r一导论文课题起止时间：至Q ! Q 生! 旦二2Q12 生三月中国医科大学( 辽宁)20 12 年4 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：熟蛆亟日期：2 丝! ! 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：目录一、摘要中文论著摘要l英文论著摘要5二、英文缩略语l O三、论文前言1 1日U 舌I材料与方法“实验结果1 3讨论1 7结论1 9四、本研究创新性的自我评价2 0五、参考文献2 1六、附录综述2 3致谢：3 5个人简介3 6中文论著摘要D E K 在非小细胞肺癌中的表达及功能研究刖罱D E K 是一种原癌基因，定位在6 p 2 2 3 染色体，在急性髓系白血病( A M L )的一亚型中第一次被报道。研究发现在多种肿瘤如视网膜母细胞瘤、肝细胞癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中，D E K蛋白均出现过表达。D E K 能部分抑制细胞的分化和过早衰老，并与恶性细胞抗凋亡相关。这些研究提示D E K 在肿瘤细胞中有多种功能，是一个重要癌基因。但是D E K 在非小细胞肺癌中的表达情况与临床病理因素的关系还不清楚，其对肺癌细胞的作用及其作用机制未见文献报道。我们检N t H , 细胞肺癌中D E K 的表达情况，分析了D E K 表达与临床病理因素的关系，通过干扰肺癌细胞系A 5 4 9 S P C 中D E K 的基因表达，探讨了D E K 对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡影响。材料与方法1 、组织来源1 1 2 例原发性非小细胞肺癌标本及3 8 例相应正常肺组织标本来自中国医科大学附属第一医院病理科存档蜡块，患者术前均未接受放化疗。男性7 2 例，女性4 0 例，年龄3 6 - - - 7 6 岁，平均年龄6 l 岁。按2 0 0 4 年W H O 肺肿瘤组织学分类标准：鳞癌4 8 例，腺癌6 4 例；高分化4 1 例，中分化4 7 例，低分化2 4 例，有淋巴结转移4 3 例，无淋巴结转移6 9 例。依据国际抗癌联盟( U I C C ) 修订的肺癌T N M 分期标准：l 期5 5 例，I I 期3 3 例，I I I 期2 4 例。2 、免疫组织化学染色免疫组化检测试剂盒和浓缩型D A B 试剂盒为福建迈新生物工程有限公司产品，D E K 多克隆抗体为P r o t e i n T e c hG r o u p 中国分公司武汉三鹰生物技术有限公司产品。操作步骤简略为：将石蜡组织块切成4 p m 厚的切片，脱蜡，脱水，在柠檬酸盐抗原修复液中修复后，按S P 法操作步骤进行，一抗用抗D E K 的多克隆抗体( 1 ：2 0 0 ) 4 0 C 孵育过夜，生物素标记的二抗3 7 0 C 孵育3 0 分钟，D A B 显色，苏木素染色。为证明D E K 蛋白抗体免疫组化检测的特异性，实验中以鼠I g G 代替一抗作为对照，结果阴性。同时，选择D E K 蛋白阳性染色的切片，以P B S 代替一抗的染色结果为阴性作为可信的实验依据。3 、免疫组化结果判定标准结果判定：以棕褐色颗粒位于细胞核内判定为D E K 阳性染色结果。并根据B e e s l e y 分级法，按阳性细胞数的比例将染色结果分为4 级。0 级：阳性细胞数为0 , - - 5 ；1 级：阳性细胞数为6 2 5 ：2 级：阳性细胞数为2 6 0 旷5 0 ；3 级：阳性细胞数为5 0 以上。同时，计算阳性率的方法设定为：( 1 ) 阳性率：指l 级和1 级以上的阳性染色病例百分数；( 2 ) 强阳性率：指2 级和2 级以上的阳性染色病例百分数。4 、细胞培养和s i R N A 干扰人肺腺癌A 5 4 9 细胞系用含有1 0 胎牛血清和1 0 0 U m L 青链霉素的D M E M培养基，肺癌细胞系S P C 用含有1 0 胎牛血清和1 0 0 U m L 青链霉素的1 6 4 0 培养基培养，均在3 7 “ C ，5 C 0 2 条件的培养箱内培养。转染前2 4 小时将细胞按5 0 密度接种于6 孔板，采用D h a n I l a F E C Tl 转染试剂进行转染，转染4 8 小时后使用P C R 和W e s t e r nb l o t 检测干扰效率。5 、R r P C R对于培养的细胞或者剪碎的组织利用T r i z o l 试剂( I n v i t r o g e n ，U S A ) 裂解，然后按照说明书的步骤，提取总的R N A 。我们使用A M VV e t 3 0 ( T a k a r a ，S h i g a ，J a p a n )试剂盒。P C R 产物通过2 的琼脂糖凝胶电泳，采用( I m a g eJ ) B i o I m a g i n gS y s t e m进行灰度值测定，以l B - a e t i n 作为内参。6 、W e s t e r nB l o t 法检测蛋白表达收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心“，1 5 0 0 0 转m i n ，1 5 m i n ) ，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为6 0 l a g 。电泳( 1 0 S D S P A G E 凝胶) 、转印( 5 0 V , 9 0 m i n ) 、5 i E 常小牛血清封闭，抗D E K ( 1 ：2 0 0 0 , p r o t e i n T e c h ) 和抗I $ - a c t i n ( 1 ：5 0 0 ) ，4 1 2 孵育过夜，分别与对应的二抗( 1 ：4 0 0 0 ，s a n t ac r u z ，U S A ) 室温孵育2 h ，E C L显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪( C h e m iI m a g e r5 5 0 0 ，A l p h aI n n o t e c h ，U S A )2采集，进行灰度值测定。7 、M T T 法检测细胞增殖及集落形成实验将单个细胞悬液接种于9 6 孔培养板中，每孔体积1 0 0 u l 含3 5 x l ( P 个细胞，培养2 4 h r ，每孔加入M 1 T ( 3 一 4 ，5 - 2 一y q - 2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ) 溶液( 5 m g m l ，S i g m a ，U S A ) 继续培养4 h r ，吸去上清液，加入1 5 0 u l D M S O ( S i g m a ，U S A ) ，振荡1 0 m i n ，4 9 0 n m 波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。集落形成实验在干扰4 8 小时后接种4 0 0 个细胞于6 c m培养皿中2 周后用苏木素染色8 、数据分析采用S P S S l 3 0 统计分析软件进行数据分析，对D E K 表达和临床病理因素的关系用卡方检验；采用t 检验检测R T - P C R 和W e s t e r nB l o t 结果中的灰度值。以P 5 0 p o s i t i v ec e l l s O n l yn u c l e a re x p r e s s i o nW a sc o n s i d e r e da Sp o s i t i v es t a i n i n g 4 C e l lc u l t u r eH u m a nl u n gc a n c e rc e l ll i n e sA 5 4 9 ( a d e n o c a r c i n o m a ) w a sc u l t u r e di nD M E M ，s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 f e t a lb o v i n es e r u m ，a t3 7 “ Ci na5 C 0 2i n c u b a t o r H u m a nl u n gC a n C e rc e l ll i n e sS P C ( a d e n o e a r c i n o m a ) W a sc u l t u r e di n16 4 0，s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 f e t a lb o v i n es e r u l n a t3 7 “ Ci na5 c 0 2i n c u b a t o r 6S m a l li n t e r f e r i n gR N At r e a t m e n t ：D E Ks i R N Aa n dn e g a t i v ec o n t r o ls i R N Aw e r ea l lp u r c h a s e df r o mS h a n gh a iG e n e P h a r m a F o rt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n ，c e l l sw e r ec u l t u r e di na6 - w e l lp l a t e2 4hb e f o r et h ee x p e r i m e n t T h e nc e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hs i R N Au s i n gt h eD h a r m a F E C T1 ( T h e r m o F i s h e rS c i e n t i f i c ) a c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r si n s t r u c t i