东北农业大学硕士学位论文共表达猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位重组乳 酸杆菌构建及其免疫学初步评价姓名：王相清申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李一经20090620摘 要 摘 要 以干酪乳杆菌 Lactobacillus casei ATCC 393（L.casei 393）作为递呈抗原口服疫苗活菌 载体，将猪细小病毒保护性抗原 VP2 蛋白的基因片段与大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位 （LTB）作为目的基因，构建了共表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原 VP2 蛋白与 LTB 的 重组干酪乳杆菌表达系统，经过动物免疫试验，分析比较了共表达 VP2-LTB 重组干酪乳杆 菌与单独表达 VP2 重组干酪乳杆菌系统免疫效果及细胞表面表达与分泌表达两种不同表达 方式的免疫效果。 根据目的基因和融合表达载体质粒的特点，应用 Primer Premier 5.0 软件进行设计引物。 以 pMD18-T-VP2 质粒和 pMD18-T-LTB 质粒作为模板， 通过 PCR 扩增分别得到大约 1750bp 的 VP2 基因和约 375bp 的 LTB 基因，PCR 产物经酶切后，胶回收连接，并以连接产物为模 板，以 VP2 的上游引物和 LTB 的下游引物扩增 VP2-LTB，经 PCR 扩增出约 2.1kb 的目的基 因 VP2-LTB，将该基因片段克隆到 pMD18-T simple 载体，并进行了酶切、PCR 鉴定和序列 测定，重组质粒命名为 pMD18-T-VP2-LTB。重组质粒经 BamHI 和 XhoI 双酶切，回收目的 基因片段 VP2-LTB，分别与经同样双酶切的表达载体 pPG-1 和 pPG-2 连接，电转化感受态 L.casei 393， 筛选阳性克隆， 并进行酶切、 PCR 和测序鉴定， 重组质粒命名为 pPG-1-VP2-LTB 和 pPG-2-VP2-LTB，重组干酪乳杆菌命名为 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 和 pPG-2-VP2LTB /L.casei 393。 构建的两种重组菌 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 和 pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 在 MRS 培养液中进行培养，以 2%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。重组菌目的蛋白的表达 和定位通过 SDS-PAGE、Western blot 和免疫荧光及免疫胶体金电镜鉴定。细胞表面表达型 重组干酪乳杆菌经诱导后的 SDS-PAGE 检测结果表明，有约 80kD 的融合蛋白得到了表达， 表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot 结果分析表明，表达的蛋白可被鼠源 PPV 抗血 清所识别， 间接免疫荧光及免疫胶体金电镜实验结果表明， 所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌 菌体表面检测到； 分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后， 对诱导表达的菌体及培养上清液进 行 SDS-PAGE 检测表明， 有约 75kD 蛋白得到了表达， 表达蛋白的大小与理论值相符。 Western blot 结果分析所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性，实验表明，重组的目的 蛋白获得了分泌表达。 为检验构建的重组菌是否能诱导黏膜和系统免疫应答以及 LTB 作为粘膜免疫佐剂的作 用，本实验以 BALB/c 小鼠为试验动物，进行免疫学实验。将 BALB/c 小鼠分为五组，每组 10 只，通过口服途径分别免疫接种 109活菌量 pPG-1/L.casei 393、pPG-1-VP2/L.casei 393、 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393、pPG-2-VP2/L.casei 393、pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393，每隔 2w 免疫一次，共免疫四次，每次连续免疫 3d，一天免疫一次。于免疫前、初次免疫后第 7d、 21d、35d、49d 采集免疫小鼠血液；免疫前、初次免疫后第 1d、5d、12d、19d、26d、33d、 40d、47d 和 54d 采集免疫口服免疫组小鼠收集粪便；眼洗液和外生殖道洗液是在免疫前、 初次免疫后第 7d、21d、35d、49d 分别以 100l 的 PBS 冲洗眼结膜和冲洗外生殖道获得。 所有收集的样品保存于20备用。最后测定了小鼠粪便及眼洗液和外生殖道洗液样品中抗 PPV VP2 分泌型 IgA 及小鼠血清样本中抗 PPV 的特异性 IgG 水平。 通过 ELISA 方法来检测黏膜样品中特异性分泌型 IgA 抗体的水平，来评价黏膜免疫反 应情况，在粪便、眼洗液和外生殖道洗液中均检测到了高水平的特异性 IgA，与对照组相比 差异显著。其中，免疫组 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 和 pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 的小鼠 粪便、眼洗液和外生殖道样品中 IgA 抗体水平与免疫组 pPG-1-VP2/L.casei 393 和 pPG-2-VP2/L.casei 393 相比，差异显著（P0.05）或极显著（P0.01）。初步分析是共表达 黏膜免疫佐剂 LTB 的缘故，表明 LTB 能加强黏膜系统反应。本研究实验结果初步认为 LTB东北农业大学农学硕士学位论文 II作为一种安全有效的佐剂，具有极大的应用潜力。 共表达 VP2-LTB 重组干酪乳杆菌免疫组与单独表达 VP2 重组干酪乳杆菌免疫组相比， pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 或 pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 中小鼠血清中 IgG 的效价高于 pPG-1-VP2/L.casei 393 或 pPG-2-VP2/L.casei 393 组，与免疫对照组比较，差异显著，并且分 泌型的重组菌免疫性更好。在本研究中，口服免疫表达 VP2-LTB 的重组乳酸菌不仅能诱导 产生黏膜免疫， 而且诱导产生了系统免疫， 并且通过口服免疫产生的黏膜免疫反应不只局限 于胃肠道，也引起了其他黏膜部位的免疫反应，而且共表达 VP2-LTB 组的重组乳酸菌免疫 后的 sIgA 抗体水平高于单独表达 VP2 组的重组乳酸菌。 机体通过分泌性 IgA 抗体在黏膜表 面对病原体进行排斥和清除，这对预防细小病毒感染是至关重要的。 中 和 试 验 结 果 表 明 ， pPG-1-VP2/L.casei 393 组 、 pPG-2-VP2/L.casei 393 组 、 pPG-1-VP2-LTB/L.casei 393 组、 pPG-2-VP2-LTB/L.casei 393 组在免疫后 49d 血清的抗体中和 效价分别为 1:304、1:317、1:338、1:352。 本研究首次构建了重组大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位和猪细小病毒主要免疫保护性 抗原 VP2 蛋白的干酪乳杆菌细胞表面表达和分泌表达系统。本研究所获得的结果表明，干 酪乳杆菌可用做口服免疫传递抗原引起黏膜和系统免疫。当 VP2 蛋白与 LTB 共表达时，加 强了黏膜免疫反应，LTB 具有较好的免疫原性、抗原性和佐剂特性，可被用于基因工程疫 苗的研制，很适合于用做黏膜疫苗的免疫佐剂。本研究为进一步研究新型、有效的猪细小病 毒口服疫苗奠定了基础。 关键词关键词 猪细小病毒 VP2 蛋白； 干酪乳杆菌； 大肠杆菌不耐热肠毒素 B 亚单位； 共表达； 免 疫学评价Abstract Co-expressing VP2 Protein of Porcine Parvovirus with E.coli Heat-labile Toxin B subunit protein in Recombinant Lactobacillus casei and Immunology Evaluation Abstract Lactobacillus casei ATCC 393 (L.casei 393) was selected as an antigen delivery vehicle for the development of live mucosal vaccine. The main protective antigen VP2 of porcine parvovirus and E.coli heat-labile toxin B subunit were selected as the target gene. We constructed recombinant L.casei 393 systems which co-expressing VP2 protein and E.coli heat-labile toxin B subunit protein. The immunogenicity responses induced by oral mucosal immunizations with recombinant strains which with LTB or without LTB were compared and two kinds of recombinant strains expressing interest protein in different cellular locations were also analyzed. We designed primers with Primer Premier 5.0 software according with target gene and considering the characters of fusion expression vector plasmid. About 1750bp gene fragment (VP2) and 375bp gene fragment were amplified by PCR using the plasmid pMD18-T-VP2 and the plasmid pMD18-T-LTB. The PCR products were digested by restriction enzyme, linked by T4 DNA ligase. About 2.1kbp gene fragment (VP2-LTB) was amplified by PCR using the product of linked. The interest gene fragment VP2-LTB was cloned into plasmid pMD18-T simple followed enzyme digestion, PCR identification and sequence analysis, and the recombinant plasmid was named pMD18-T-VP2-LTB. Then the pMD18-T-VP2-LTB plasmid was doubly digested by BamHI and XhoI, and the interest gene fragment VP2-LTB was obtained by agar gel purification, linked with expression vector pPG-1 and pPG-2 doubly digested by BamHI and XhoI, giving rise to pPG-1-VP2-LTB and pPG-2-VP2-LTB. The recombinant plasmids pPG-1-VP2-LTB and pPG-2-VP2-LTB were electroporated into L.casei 393 respectively, generating pPG-1-VP2-LTB/- L.casei 393 and pPG