A M P K 激活剂m e t f o r m i n 和A I C A R 抑制紫外线辐射诱导皮肤癌的机制研究A I C A Ra n dm e t f o r m i np r e v e n tU V B - - i n d u c e ds k i nt u m o r i g e n e s i st h r o u g hA M P K d e p e n d e n ta n d- i n d e p e n d e n tm e c h a n i s m s导论文课题起止时间：至QQ 2 生2 月二2Q 12 生垒且中国医科大学( 辽宁)20 12 年4 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：纭参历日期：矽P ：f ：f 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期I “ - 1 论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名：j 堕指导教师签名：苤! ! 磕日期：皿! 兰：! ：! 三目录一、摘要中文论著摘要l英文论著摘要8二、英文缩略语2 0三、论文论文一前言2 l刖吾2 l材料与方法2 2结果2 6讨论? 3 0参考文献3 4论文二前言3 6日舌3 6材料与方法3 6结果4 0讨论4 9结论5 4四、本研究创新性的自我评价5 6五、参考文献5 7六、附录综述6 0致谢6 9个人简介7 l中文论著摘要A M P K 激活剂A I C A R 和M e t f o r m i n 抑制紫外线辐射诱导皮肤癌的机制研究上J L 刖吾日光紫外线( u l t r a v i o l e t r a d i a t i o n ，u v ) 照射可引起急性损伤如日晒伤和慢性累积性损伤如皮肤癌及光老化。日光中紫外线诱导的D N A 损伤是导致皮肤癌发生的一个重要因素，同时在皮肤癌细胞中发现，调控细胞增殖、分化和凋亡的特异性基因出现与紫外线损伤相关的变异。根据日光中紫外线波长的不同，可将其分为3种：U V A ，U V B 和U V C ，造成生物损害的紫外线主要是波长短，能量较高的U V B ( 波长2 9 0 3 2 0 n m ) ，是导致D N A 损伤的主要类型。目前已证实一些原癌基因和抑癌基因由于紫外线引起的D N A 损伤而发生变异。U V 诱导产生皮肤癌是一个复杂的过程，涉及到许多细胞和分子水平上的变化，同时还与D N A 的修复作用相关。肿瘤的发生、发展及远处转移是一个复杂的过程，事实上，恶性增生多数是由多种因素和多条信号转导通路失调促成的。磷酸腺苷活化蛋白激酶( A M P K ) 是体内的能量调节器，A M P K 激活后可促进葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化，减少脂肪酸、胆固醇和蛋白质的合成，储存能量，被称为“细胞能量调节器“ ，近年来关于该通路在肿瘤的发生发展中的作用研究很多，发现其在多种肿瘤中表达缺失。A I C A R 和m e t f o r m i n 是目前研究最多的A M P K J $ _ 路激活剂，本文通过体外细胞实验及构建S K H l 无毛小鼠紫外线致皮肤癌模型研究该药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预防和治疗作用，并阐明其机制。目的本实验拟观察A I C A R 和m e t f o r m i n 处理的正常人上皮角化细胞( n o r m a lh u m a ne p i d e r m a lk e r a t i n o c y t e s ，N H E K ) 及A M P Kw i d e t y p e ( W T ) 和A M P Kk n o c k d o w n( K D ) 鼠胚胎成纤维细胞( m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t ，M E F ) ，经过紫外线( 主要是U V B ) 辐射后A M P K 通路相关分子改变，及D N A 损伤修复改变，并通过构建紫外线致S K H 。l 无毛小鼠皮肤癌模型研究这两种药物对紫外线辐射诱导皮肤癌的预防和治疗作用，并探讨其作用机制。材料与方法l 、常规培养的M E F 细胞W T 和K O ，加或不加A I C A R 及m e t f o r m i n 处理2 4 ，4 8 ，7 2 h 后，M T S 方法检测细胞存活曲线。2 、常规培养的M E F 细胞，W T 和K D ，照射U V B ( 1 0 焦耳) ，后0 ，6 ，2 4 ，4 8 h提取D N A ；常规培养的M E F 细胞W T 和K D 分别加或不加A I C A R 及m e t f o r m i n培养2 4 h 后，照射U V B ( 1 0 焦耳) ，后O ，6 ，2 4 h 提取D N A ；S K H 1 无毛小鼠，U V B照射前1h ，后背涂或不涂丙酮配置的A I C A R 和m e t f o r m i n 溶液，进行单次U V B照射后处死小鼠，剥离皮肤提取D N A ；S l o tB l o t 方法检测U V B 照射后不同时间D N A 片段C P D 及6 4 P P 修复情况。3 、动物实验：动物培养遵守芝加哥大学动物保护和使用机构条例，分为2 部分，第一部分，预防辐射致皮肤癌模型：S K H 1 无毛小鼠，分为4 组，对照组，单纯照射组，A I C A R ( 1 u m 0 1 ) 处理组，M e t f o r m i n ( 2 u m 0 1 ) 处理组，每周U V B照射( 1 0 0 m J c m 2 ) 三次，连续2 5 周，实验组小鼠每次照射前后背照射区域皮肤涂A I C A R 或m e t f o r m i n 。每周记录小鼠体重变化及皮肤变化，记录肿瘤发生时间，及肿瘤数目。第二部分，辐射致皮肤癌治疗模型：S K H 1 无毛小鼠，每周U V B照射( 1 0 0 m J c m 2 ) 三次，至1 7 周，按照生成肿瘤大小及数目随机分为单纯照射组，m e t f o r m i n 涂药治疗组，m e t f o r m i n 灌胃治疗组，继续照射，每日照射前进行相应处理。继续每周记录肿瘤数目，大小变化。4 、提取细胞蛋白，小鼠后背皮肤蛋白，采用W e s t e r n b l o t 法检测E R K 通路相关分子变化及D N A 修复相关蛋白变化。5 、H E 染色观察照射后各组小鼠皮肤上皮增生增厚情况。6 、免疫组化方法检测照射后小鼠正常皮肤及肿瘤组织增殖因子鼬6 7 表达情况。7 、采用P r i s m5 ( G r a p h P a ds o t t w a r e ，S a nD i e g o ，C A ) 统计软件分析，所有数2据用3 次独立实验的均值士标准误表示，采用t 检验及方差分析，P le n a ) a n ds m a l ll e s i o n s ( d i a m e t e r M ，e ta 1 G r o w i n gr o l e sf o rt h em T O Rp a t h w a y C u r rO p i nC e l lB i o l ，2 0 0 5 ，1 7 ：5 9 6 石0 3 31S a r b a s s o vD D ，A l iS M ，S e n g u p t aS ，e ta 1 P r o l o n g e dr a p a m y c i nt r e a t m e n ti n h i b i t sm T O R C 2a s s e m b l ya n dA k t P K B M o lC e l l 2 0 0 6 ，2 2 ：15 9 - 16 8 3 2K i mJ E ，C h e nJ R e g u l a t i o no fp e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t o rg a m m aa c t i v i t yb ym a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i na n da m i n oa c i d si na d i p o g e n e s i s D i a b e t e s 2 0 0 4 ，5 3 ：2 7 4 8 - 2 7 5 6 3 3V i g n o tS ，F a i v r eS ，A f u i r r eS e ta Lm T O Rt a r g e t e dt h e r a p yo fc a n c e r 谢n lr a p a m y c i nd e r i v a t i v e s A n nO n c 0 1 2 0 0 5 ，16 ：5 2 5 5 3 73 4H u d e sG ，C a r d u c c iM ，T o m c z a kP ，e ta 1 T e m s i r o l i m u s ，i n t e r f e r o na l f a ，o rb o t hf o ra d v a n c e dr e n a lc e l lc a r c i n o m a NE n g lJM e d 2 0 0 7 3 5 6 ：2 2 71 - 2 2 81 3 5W a nX ，H a r k a v yB ，S h e nN ，e ta 1 R a p a m y c i ni n d u c e sf e e d b a c ka c t i v a t i o no fA k ts i g n a l i n g