RNA 甲醛变性凝胶电泳甲醛变性凝胶电泳实验原理实验原理 判断 RNA 提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的 RNA 制品的电泳图谱应可清晰看到 18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA 的三条带，且 28s rRNA 的 亮度应为 18s rRNA 的两倍。 材料、试剂及器具材料、试剂及器具 1、 材料 总 RNA 提取物。 2、 试剂 (1)0.1%DEPC 水200ml 双蒸去 离子水加 0.2mlDEPC 焦炭酸二乙酯混匀室温放置过夜高压灭菌。 (2)10x 电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0) NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L(3)50mL 变性琼脂糖凝胶(1%) 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC 水 36.5 mL 加热溶解稍冷 却加入 8.5 mL 37%甲醛。(5)上样缓冲液50%甘油1mmmol/LEDTA0.4% 溴酚兰0.4%二甲苯蓝。 (6)甲酰胺(去离子)。 3、器具 (1)电泳系统 (2)紫外透视仪四、操作步骤1、 将制胶用具用 70%乙醇冲洗一遍晾干备用。2、 制胶 称取 0.5g 琼脂糖粉末加入放有 36.5mL 的 DEPC 水的锥形瓶中加热使琼 脂糖完全溶解。稍冷却后加入 5mL 的 10x 电泳缓冲液、8.5mL 的甲醛。然后在胶槽中灌制 凝胶插好梳子水平放置待凝固后使用。 3、 加样 在一个洁净的小离心管中混合以下试剂电泳缓冲液(10x)2l、甲醛 3.5mL、 甲酰胺 10mL、RNA 样品 3.5l。混匀置 60保温 10min冰上速冷。加入 3l 的上样 缓冲液混匀取适量加样于凝胶点样孔内。同时点 RNA 标准样品。 4、 电泳 打开电泳仪稳压 7.5V/cm 电泳。 一、试剂：一、试剂：DEPC（Sigma 公司产品），MOPs（Bocherigmer 公司产品），甲酰胺 （Formamide，Sigma 公司产品），溴酚蓝（Bromphenol Blue，Sigma 公司 产品）。EDTA-Na2，氢氧化钠，醋酸钠，甲醛，甘油，分析纯，国产。二、试剂配制：二、试剂配制：1、DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水 2L，在通风橱中，加入 2ml DEPC 到 2 升去离子水中，终浓度为 0.1%的 DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放 在摇床中中速摇荡至少 4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15 磅灭菌 20min。2、10 FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM 的 MOPs，50 mM 的 NaAc，10 mM 的 EDTA）：配制 500ml，称取 3.4g NaAC3H2O 放入 1000ml 烧杯中，加入 400ml DEPC 处理过的去离子水，加入搅拌子，放在磁 力搅拌器上溶解。然后加入 20.9g MOPs，放在磁力搅拌器上溶解。再加 1.86g EDTA 二水二钠，放在磁力搅拌器上溶解。用 1M 灭过菌的 NaOH 调 PH 至 7.0（约用 NaOH 40ml），用 DEPC 处理过的去离子水定容至 500ml，装入棕 色瓶中，写好标签，室温避光保存。4、5 甲醛变性胶加样缓冲液（5loading buffer）： 配制 10ml。预先配制水 饱和的溴酚蓝溶液：在 1.5ml 离心管中加入约 0.1mg 溴酚蓝，加入 1ml DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体 即水饱和的溴酚蓝液。在 15ml 灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：4.0ml 10 FA buffer 3.1ml 甲酰胺 2.0ml 100%的甘油 720ul 37%的甲醛 80ul0.5M 的 EDTA （PH 8.0） 16ul 水饱和的溴酚蓝 100ul DEPC 水 混匀，分装，-20保存，常用放 4保存。5、1甲醛变性胶电泳缓冲液（1running buffer）：20 ml 10FA gel buffer，4.0 ml 37%的甲醛，176 ml 水，放入电泳槽中使用，一般在 3 次电泳 结束后需更换此电泳缓冲液。6、1.2%的甲醛变性胶：称 0.4 克琼脂糖，加入 3.34 ml 10FA gel buffer，加 入 30 ml DEPC 水，微波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约 50-60，再加入 600 l 甲醛，倒入 7.55.0 cm 的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温放置约 30min 后即可使用。三、实验方法三、实验方法一般取 0.3 g 的总 RNA，加入 1/5 体积的 5加样缓冲液，65加热 5 min，冰 上骤冷，以消除 RNA 的二级结构。建议上样前在 RNA 样品中加入 0.5-1.0 ul 的溴化乙锭（EtBr，浓度 1.0 mg/mL），而不在胶中加 EtBr，这样电泳后的背 景较低。配好的 1.2%的甲醛变性胶先在 1甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳 15min。RNA 样品在 5-10 V/cm 的电压下电泳 30min。图 1 是我们实验室用以 上方法检测酵母总 RNA 的电泳图。图 1 酵母 total RNA 的甲醛变性胶电泳。1，酵母 total RNA（0.3 g）；2，酵 母 total RNA（0.5 g）；3，RNA Marker（0.2 g）。RNA 的质量判断标准是有 清晰的 26S，18S 条带，无降解，且肉眼观察 26S 条带亮度约是 18S 的 1-2 倍。