C a 2 + 一E R K l 2 一C R E B 信号通路在锎暴露子代大鼠学习记忆功能受损中的作用及机制E f f e c to fL a t h a n u mc h o l r i d eo nl e a r n i n ga n dm e m o r yt h r o u g hC a 2 + 一E R K1 2 一C R E Bp a t h w a yi nt h eh i p p o c a m p u so fo f f s p r i n gr a t s一一一导论文课题起止时间：2Q ! Q 生三月二至Q 12 生兰旦论文完成时间：2Q12 生垒旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月Y 2 0 9 17 5 4 纱中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名： 丕经日期：丝! 兰：竖少论文作者签名：垃丝日期：塑! 三：= ：Z 户中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要5二、英文缩略语1 0三、论文肖f 。占1 1日U 舌材料与方法1 3实验结果1 8讨论2 6结论2 9四、本研究创新性的自我评价3 0五、参考文献3 1六、附录综述3 5在学期间科研成绩4 5致谢4 6个人简介4 7中文论著摘要C a 2 + E R K l 2 C R E B 信号通路在镧暴露大鼠学习记忆功能受损中的作用及机制刖吾稀土元素( r a r ee a r t he l e m e n t ，R E E ) 是自然界广泛存在的一组化学性质相近的镧系元素以及与镧系相关密切的钪和钇，共1 7 种元素，分为轻稀土元素和重稀土元素。随着稀土的开采以及在农业、畜牧业、水产养殖、工业和医药等领域中的应用日渐扩展，越来越多的稀土元素通过不同途径进入环境，并且可以经空气粒子的形式被人体吸入或通过食物链的作用被人体摄取，进而在人体组织器官中蓄积。因此，稀土对环境、生态和人体健康的影响，以及近期和远期的生物学效应也越来越引起人们的关注。研究表明，稀土元素具有神经毒性。流行病学调查发现稀土矿区儿童的智商，记忆，注意力及推理能力均较对照区儿童明显低下。与流行病学调查结果一致，动物实验也证实了稀土元素的神经毒性作用，具体表现为受试动物的学习记忆明显受损，影响脑内微量元素稳态，酶和神经递质系统。M A P K 信号转导通路是普遍存在于多种生物中的一条极其重要的信号通路，其亚族的E R K 信号转导通路与学习记忆功能有重要的联系。研究表明，兴奋性神经递质谷氨酸作用于N M D A R 后，引发C a 2 + 大量内流，使E R K l 2 磷酸化而激活，活化后的E R K l 2 转位至胞核，作用于C R E B 并使之磷酸化而激活。C R E B 激活后，其碱性区与C R E 结合，启动B D N F 的基因转录和蛋白合成。镧是轻稀土元素的代表，且化学性质活泼，几乎能与所有的元素和组织成分发生反应，目前其对神经系统的毒作用机制和作用靶点尚不完全清楚。本课题拟给予大鼠氯化镧饮水染毒，比较不同剂量组染毒大鼠空间学习记忆能力，海马神经细胞中C a 2 + 含量，E R K l 2 蛋白表达水平，磷酸化E R K l 2 和磷酸化C R E B 蛋白表达水及B D N F 的基因转录与蛋白表达水平，探讨镧对C a 2 + 一E R K l 2 一C R E B信号通路的影响并明确该通路在损害学习记忆中的作用，为深入阐明镧的神经毒作用机制提供新的实验资料。实验分组从妊娠开始分别给予大鼠0 2 5 、0 5 和1 L a C l 3 蒸馏水溶液饮水染毒直至仔鼠断乳后1 个月，对照组给予蒸馏水。研究方法1 、M o r r i s 水迷宫测定镧暴露大鼠学习记忆损伤情况2 、F u r a 2 A M 荧光探针法测定镧暴露大鼠海马神经细胞内游离C a 2 + 水平3 、W e s t e r n B l o t 法测定镧暴露大鼠海马E R K l 2 蛋白表达水平4 、W e s t e r n B l o t 法测定镧暴露大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平5 、W e s t e r n B l o t 法测定镧暴露大鼠海马P C R E B 蛋白表达水平6 、R e a l t i m eP C R 法测定镧暴露大鼠海马B D N Fm R N A 表达水平7 、W e s t e r n B l o t 法测定镧暴露大鼠海马B D N F 蛋白表达水平结果皇日7 卜1 、大鼠M o r r i s 水迷宫测定结果在定位航行实验中，0 2 5 L a C l 3 组大鼠寻找平台潜伏期和游泳距离显著高于对照组( P O 0 5 ) 。4 、大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平0 2 5 L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平显著低于对照组( 尸 0 0 5 ) 4 、T h ep - E R K l 2p r o t e i n se x p r e s s i o nl e v e l si nt h eh i p p o c a m p u so f r a t sT h ee x p r e s s i o nl e v e l so fp E R K l 2p r o t e i n si nt h eh i p p o c a m p u so f0 2 5 L a C l 3g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s eo fc o n t r o lg r o u p ( P O 0 5 ) ，且各染镧剂量组间亦无统计学意义( 尸 0 0 5 ) 。 - 啊一心2 _ - - -f l - a c t i n趸O 喜秘。装量釜 天；I n舍 翟譬 矗- o 摹 、一 楚_ 譬2 图c o n t r o lO 2 5 L a C B0 5 0 d a C D1 L a C L 3园日玳1 圈盱祀图5 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马E R K I 2 蛋白的表达水平的灰度值4 、镧对大鼠海马p - E R K I 2 蛋白表达水平的影响如图6 ，图7 所示，0 2 5 L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平显著低于对照组( 尸 O 0 5 ) ，O 5 L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平显著低于对照组和0 2 5 L a C l 3 组俨 O 0 5 ) ，1 L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平显著低于对照组、0 2 5 L a C l 3 和O 5 L a C l 3 组( P O 0 5 ) 。P E R K l 2H i s t o n 一1l 朋一百 鲁 8jU 对J 摹l nqooU 砖J 装 oo 犍J 摹图6 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白表达水平守C暑 芏葛邑g菱 鬯囱p B R K l 田p l 象K 2图7 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马p - E R K l 2 蛋白的表达水平的灰度值注：与对照组比， 0 0 5 ；与0 2 5 L a C l 3 组比，孥 O 0 5 ；与0 5 L a C l 3 组比，a , e o 0 5 。5 、镧对大鼠海马p - C R E B 蛋白表达水平的影响如图8 ，图9 所示，0 2 5 L a C l 3 组大鼠海马p - C R E B 蛋白表达水平显著低于对照组( 尸 0 0 5 ) ，0 5 L a C l 3 组大鼠海马p - C R E B 蛋白表达水平显著低于对照组和0 2 5 L a C l 3 组( P O 0 5 ) ，1 L a C l 3 组大鼠海马p - C R E B 蛋白表达水平显著低于对照组、0 2 5 L a C l 3 和0 5 L a C l 3 组( P 0 0 5 ) 。P C R E BH i s t o n 1r “ l m ，w 一。一+ 1 一h _ 1t L - - l 一捌_ - _ _ - - _ - _ - _ 鼬r _ 麓_ 麓_ 嘲礴鳃舞簟_量 8oU 时 一 摹I nqoo 嘻 一 装 叼ooU 时 一 装，_图8 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马p - C R E B 蛋白表达水平茔葛言是 甚图9 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马p - C R E B 蛋白的表达水平的灰度值注：与对照组比， O 0 5 ；与0 2 5 L a C l 3 组比，擎 O 0 5 ；与O 5 L a C l s 组比，印 0 0 5 。6 、镧对大鼠海马B D N Fm R N A 表达水平的影响如图1 0 所示，0 2 5 L a C l 3 组大鼠海马B D N Fm R N A 表达水平显著低于对照组( P O 0 5 ) ，O 5 L a C l 3 组大鼠海马B D N Fm R N A 表达水平显著低于对照组和0 2 5 L a C l 3 组俨 0 0 5 ) ，1 L a C l 3 组大鼠海马B D N Fm R N A 表达水平显著低于对照组、0 2 5 L a C l 3 和0 5 L a C l s 组伊 0 0 5 ) 。罗孺壬，壬。托壬图1 0 ，不同剂量L a C l 3 组大鼠海马B D N Fm R N A 的表达水平盘eo-o至瘟)0l霸-p墨Hoz笛暑z盘鼻注：与对照组比， o 0 5 ；与0 2 5 L a C l 3 组比，孥 0 0 5 ；与o 5 L a C l 3 组比，e , p o 0 5 。7 、镧对大鼠海马B D N F 蛋白表达水平的影响如图1 1 ，图1 2 所示，0 2 5 L a C l 3 组大鼠海马B D N F 蛋白表达水平显著低于