开菲尔粒中一株高加索酸奶乳杆菌的分离及鉴定Identification of a Strain of Lactobacillus Kefiri Isolated from Kefir Grains摘 要 目的：确从黑龙江民间流传使用的开菲尔粒中分离到一株优势乳酸菌，并命名为 HUCM 101，经形态学及 16SrR NA 序列分析，鉴定为高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri） ，其 16S rR NA 基因序列在国际 Genbank 数据库中的序列注册号为 KC845576。关键词：开菲尔；高加索酸奶乳杆菌；分离；鉴定Abstract:Objective: One predominant lactic acid bacteria named HUCM 101 was isolated from the kefir which was used popularly among folk families of Heilongjiang, China. This bacteria was identified to be Lactobacillus kefiri by phenotypical characteristics and 16S rRNA sequences. The Genbank accession number of 16S rRNA sequences of HUCM 101 strain is KC845576. Keywords: Lactobacillus kefiri; isolation; identification开菲尔是原产自高加索地区的一种传统酒精性发酵乳 饮料，至今已有数千年的饮用历史。开菲尔是其英文名称 Kefir 的音译，Kefir 源自土耳其语“Kef” ，寓有安康、安宁、幸 福之意，并有爽快的味道的意思1 。由于开菲尔具有多种特殊 的保健功效，如抗肿瘤2 、抗突变3 、抗氧化3,4 、抗过敏5 、降血 压6 、降胆固醇7 、调节机体免疫力8 等，且风味和口感独特，因 而深受许多国家和地区消费者的喜爱，在我国的东北、内蒙 古、新疆和西藏等地区的民间家庭也有饮用 Kefir 的历史，但至今国内仍未有商业化产品上市。 传统的 Kefir 是以牛乳或羊乳为主要原料，由开菲尔粒 （Kefir Grains，简称 KG）作为发酵剂发酵而成。KG 是一种外 形不规则，表面卷曲，富有弹性，多为白色或米黄色（被杂菌3. 讨论 根据前列地尔的产品特点，我们在对赋形剂进行选择时 主要采用常用的冻干赋形剂甘露醇、葡萄糖和右旋糖酐进行 筛选，选择确定右旋糖酐为赋形剂。活性炭对本品的吸附不 大，根据常规用量，选择 0.1%作为本品的活性炭吸附用量。 测定本品的冻干共熔点后，我们参考有关文献制订了几个冻 干条件，主要根据冻干产品的外形，溶解性和含水量对冻干 条件进行选择。其中两个冻干条件制备的产品差异不大，但 综合考虑后，从经济角度考虑决定本品的冻干条件，筛选掉 其中冻干时间较长的一个，确定用 18 小时的冻干过程。 参考文献 1 李勇，唐捷.前列地尔的药理研究进展J.西南军医，2006，8（6）:79- 81. 2 杨华勇，张新军.前列地尔临床应用进展J.华西医学，2005，20 （4）:147- 149 3 中国药典2005 年版S（二部）.北京:化学工业出版社，2005:448449. 收稿日期：2013- 07- 29 810黑龙江医药 Heilongjiang Medicine Journal Vol.26 No.5 2013 污染后会呈黄色） ， 直径 320mm 不等，呈花椰菜或珊瑚状的 粒状物。KG 是由多种微生物经过长期作用后形成的微生物 共生体，其菌相极其复杂，且因来源、培养条件不同而异，主 要包括乳酸菌、酵母菌以及少量的醋酸菌等，此外也有报道 称发现过双歧杆菌9,10 。KG 的骨架主要是由乳酸菌自身代谢 产生的胞外黏性多糖（约占 50%） ，结合大量水和少量蛋白 质、脂肪以及其他成分共同构成，其中胞外多糖为微生物固 定化的主要支撑体。其在发酵过程中既有乳酸菌参与的乳酸 发酵，又有酵母菌参与的酒精发酵，故形成的 Kefir 是一种集 酸味、醇味于一体，同时伴有少量 CO2 产生的酒精性发酵乳 制品，故有“发酵乳制品中之香槟”的美誉1 。作为发酵剂的 KG，其微生物的构成与分布直接决定了 Kefir 的风味与品 质。因此，研究 KG 中微生物的组成以及获得其中的优势菌 株至关重要。本文从家庭用的开菲尔粒中分离到一株优势乳酸菌，并鉴定为高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri） 。 1. 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 开菲尔粒的来源 开菲尔粒来自黑龙江哈尔滨市的普通家庭，用来制作开 菲尔的发酵剂。 1.1.2 培养基与试剂 10%脱脂乳：10g 脱脂乳粉溶解于 100mL 蒸馏水中， 115、10min 湿热灭菌。 改良 MRS 培养基（g/L）：蛋白胨 5g，胰蛋白胨 10g，酵母 粉 5g，牛肉膏 5g，葡萄糖 20g，吐温 - 80 1g，乙酸钠 5g，MgSO 4 7H 2 O 0.58g，MnSO4 4H 2 O 0.25g，柠檬酸氢二铵 2g，K 2 HPO 4 2g。HCl 调至 pH6.2，121、15min 湿热灭菌。 细菌基因组提取试剂盒购于天根生化科技有限公司； Taq DNA 聚合酶购于宝生物工程（大连）有限公司；DNA 序 列测定由华大基因（深圳）完成；其余试剂均为分析纯。 1.1.3 主要仪器设备： 显微镜（LEICA） ，Delta320 pH 计（梅特勒 - 托利多） ，分 析天平（梅特勒 - 托利多） ，全自动高压灭菌锅，恒温培养箱， 超净工作台。 1.2 试验方法 1.2.1 开菲尔粒的活化 开菲尔粒用无菌的生理盐水充分冲洗后，将其接种于 10%脱脂乳培养基中，25恒温培养，直至活力恢复。 1.2.2 乳酸菌的分离与纯化 将活化好的开菲尔粒在无菌条件下捣碎，并重悬于无菌 生理盐水中，取菌悬液做适当浓度梯度稀释，取梯度稀释液 涂布于含 0.75% CaCO3 的改良 MRS 琼脂平板上11 ，37恒 温培养 48h 后，挑取菌落周围形成透明圈的菌落，将 G+ 菌 株继续用 MRS 琼脂平板划线，直至确定为纯菌，并记录菌落的形态特征，纯化菌株接种至改良 MRS 斜面培养基培养后， 置 4冰箱保存备用。 1.2.3 乳酸菌的鉴定 将纯化菌株进行过氧化氢酶试验，凡是革兰氏染色阳 性，过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。 在初步鉴定的基础上，进一步对分离菌株的 16S rDNA 基因序列进行分析鉴定。利用细菌基因组提取试剂盒提取菌 株的基因组 DNA，并以其为模板进行 PCR 扩增。16S rDNA 的 PCR 扩增引物分别为，正向引物 27F：5- AGAGTTTGATC CTGGCTCAG- 3，反向引物 1541R：5- AAGGAGGTGATCCA GCC- 3。 PCR 扩增条件：95 变性 5min；94 1min，58 1min，72 2min，30 个循环；72延伸 7min12 。PCR 扩增产物 直接送至华大基因（深圳）测序。 利用 BLAST 寻找与目的基因序列同源性最高的已知分 类地位的菌种。然后从 GenBank 中提取乳杆菌属内模式菌 株的 16S rRNA 基因序列，与测定的序列共同用 MEGA 5.1 软件进行多序列比较校准排齐后，以 Neighbor Joining 法构建 系统发生树，1000 次随机抽样，计算自引导值（Bootstrap）以 评估系统发生树的置信度13 。 2. 结果 2.1 乳酸菌的分离及其形态学特征 从开菲尔粒中分离到一株乳酸杆菌，并将其命名为 HUCM 101，在 MRS 琼脂平板上培养 48h 后，菌落及菌体特 征见表 1。 表 1 乳杆菌的形态学特征 菌株名称 菌 落 特 征 形状 表面 特征 隆起 形状 边缘 表面 光泽 质地颜色 透明度 排列 HUCM 101 圆形光滑低凸完整 有 黏稠乳白 不透明 单在、成对、 少数成链 形态短粗杆， 两端钝圆 菌 体 特 征 2.2 16S rDNA 基因的 PCR 扩增结果与系统发育分析 PCR 扩增得到的 HUCM 101 菌株的 16S rDNA 基因序 列大小为 1506 bp。将 HUCM101 菌株的 16SrDNA 基因序列 BLAST 后发现，该菌株与乳杆菌属内种的同源性最高。 利用 MEGA 5.1 软件，将该菌的 16S rRNA 基因序列同 GenBank 数据库中已知的乳杆菌属内模式菌株进行多序列 比较，同时以非同属的 Escherichia coli 模式菌株为外标，绘制 出系统发育树（见图 1） 。由图 1 可知，菌株 HUCM101 同 Lactobacillus kefir（iGenBank 注册号为 AJ621553）的亲缘关系 最近，序列相似性为 99%。因此，将该菌株确定为高加索酸奶 黑龙江医药 Heilongjiang Medicine Journal Vol.26 No.5 2013 811乳杆菌。菌株 HUCM101 的 16S rRNA 序列提交到 Genbank 数据库后，获得的国际基因序列注册号为 KC845576。 图 1 基于 16SrRNA 基因序列建立的乳杆菌属系统发育树 3. 讨论 开菲尔粒是一个复杂的微生物共生体系，国内外学者们 已从多层面对其微生物的组成或菌相进行了大量的研究，包 括传统的纯培养分离技术14 ，扫描电镜观察15 ，PCR 指纹图 谱技术16 ，甚至是利用宏基因组学的高通量筛选技术9 等。研 究发现，KG 中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌，还有少量的 醋酸菌。其中乳酸菌主要包括高加索酸奶乳杆菌（L. kefiri） 、 马 乳 酒 样 乳 杆 菌 （L. kefiranofaciens） 、 嗜 酸 乳 杆 菌（L. acidophilus） 、瑞士乳杆菌（L. helveticus） 、德氏乳杆菌保加利亚 亚种（L. delbrueckii subsp. bulgaricus） 、干酪乳杆菌（L. casei） 、短 乳杆菌（L. brevis）发酵乳杆菌（L. fermentum） 、格氏乳杆菌（L. gasseri） 、植物乳杆菌（L plantarum）等乳杆菌属17,18 ，肠膜明串 珠菌（Leuconostoc mesenteroides） 、柠檬明串珠菌（Leuc. citreum） 等肠膜明串珠菌属10,19 ，以及乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等 乳球菌属9,20 菌株，其中马乳酒样乳杆菌（L. kefiranofaciens）被 认为是产生 Kefir 多糖（Kefiran）的主要菌种21 ；酵母菌主要包 括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 、乳酸酵母（S. lactis） 、脆 壁酵母（S. fragilis） 、乳酒假丝酵母（Candida kefir） 、马克斯克鲁 维酵母（Kluyveromyces marxianus） 、乳酸克鲁维酵母（K. lactis） 等 15，20，21 ；醋酸菌主要包括巴氏醋杆菌（Ac. pasteurianus） 、东方 醋杆菌（Ac. orientalis）等醋杆菌属菌株10,19 。 该研究从开菲尔粒中分离到一株优势菌株，通过菌落、 菌体细胞形态，革兰氏染色以及触酶试验初步确定为乳酸 菌，随后通过该菌株的 16SrRNA 序列与其它模式菌株进行 比对并构建系统发育树，将该菌株鉴定为高加索酸奶乳杆菌 （L. kefiri） 。同时，在分