自组装法合成金磁微粒及其表征测定自组装法合成金磁微粒及其表征测定自组装法合成金磁微粒及其表征测定生物科学 2004 级 黄泓轲指导老师 杨婉身 教 授摘要：本文利用化学共沉淀法合成磁性 Fe3O4 微粒，使用硅烷化试剂 APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）在乙醇分散的 Fe3O4 微粒表面进行氨基化修饰，并通过酸碱滴定法测得氨基化 Fe3O4 微粒表面的氨基含量为 0.15 mmol/g。采用 Frens 法合成了粒径在 20nm 左右的纳米级胶体金，进一步利用 Au-N 键将金纳米微粒组装到 Fe3O4 微粒表面。可见光吸收光谱分析表明金磁微粒在 520 nm550 nm 处表现出由于 Au 存在而产生的特征吸收峰，同时原子吸收光谱分析也获得了金磁微粒的 Fe3O4:Au 元素构成比例为 1:0.97。关键字：金磁微粒 胶体金 氨基化 自组装技术GoldMag Particles Synthesized through Self-assembly Technique and Their ExosyndromeHuang Hongke Biological Science, Grade 2004Directed by Yang Wanshen (Professor)Abstract: This article aimed to introduce a chemical-coprecipitation method to synthesize magnetic Fe3O4 microparticle. The Fe3O4 microparticle dissolving in alcohol was modified by amination by using silylating reagent APTES (3-amino-propyl-tris-exethyl-silicane).The content of amino group on the surface of Fe3O4 microparticle was 0.15 mmol/g determined through acid-base titration. Colloidal gold, synthesized by Frens method, whose particle diameter was about 20nm, could be further assembled on the surface of Fe3O4 microparticle linked by Au-N valence bond. The visible light absorption spectrum indicated that GoldMag Particles showed a characteristic absorption peak caused by the existence of Au between 520 nm550 nm. Meanwhile, atomic absorption spectrum analysis demonstrated that the ratio of GoldMag Particles was 1:0.97.Keywords: GoldMag Particles, colloidal gold, amination, self-assembly technique纳米材料是指晶粒尺寸小于 100 nm 的单晶体或多晶体，由于晶粒细小，使其晶界上的原子数多于晶粒内部的，即产生高浓度晶界，因而使纳米材料有许多不同于一般粗晶材料的性能，如强度和硬度增大、低密度、低弹性模量、高电阻、低热导率等1-2。一般在 1-100 nm 之间纳米微粒具有三个共同的结构特点：(1)微粒尺寸在纳米数量级 1-100 nm；(2)存在大量的界面或自由界面或自由表面；(3)各纳米微粒之间存在着或强或弱的相互作用。纳米材料这些结构特点导致了它具有如下四方面的效应：表面效应，小尺寸效应，量子尺寸效应，宏观量子隧道效应。由于纳米微粒具有上述特殊效应，使它在光学催化、化学活性等方面具有不同于普通材料的优良性能，因而具有广阔的应用前景。磁性纳米复合微球是指通过适当的方法使磁性金属或其氧化物微球与包覆材料结合起来形成具有一定磁性及特殊结构的微球。磁性纳米微粒除具有上述纳米微粒所共有的效应及性质外，还具有不同于常规磁性材料的特性。其原因是与磁相关的特征物理长度恰好处于纳米量级，例如：磁单畴尺寸、交换作用长度以及电子平均自由程等大致处于 1-100 nm 量级，当磁性体的尺寸与这些特性物理长度相当时，就会呈现反常的磁学性质：超顺磁性、高矫顽力、低居里温度、高磁化率。目前，铁氧磁性纳米微粒由于其成本低廉，合成方便，磁响应性明显等诸多优点，在磁性纳米材料领域独占鳌头。磁性纳米微粒由于其对多种生物分子良好的相容性以及灵敏的磁响应性，已经在细胞分选、固定化酶、靶向药物、DNA 的分离、核酸杂交等诸多领域展示了巨大潜力3-4。金磁微粒（GoldMag Particles)金磁性纳米复合微粒又称金磁性纳米复合微粒，是指表面包覆层含有金纳米粒，内核为磁性材料的复合纳米微粒。根据结构和组成的不同，金磁微粒可以分为核壳型和组装型两种：在磁性粒子表面将 Au3+还原为 Au0,可得到核壳型金磁微粒；而先将磁性粒子进行有机试剂的修饰，通过 Au-S，Au-N 等原子之间的相互作用将纳米金微粒吸附在磁性颗球表面可形成组装型的金磁微粒5。金纳米微粒在生物化学上的应用是近十几年来的一个热点。它无毒、化学性质稳定、制备过程简单，不仅能在水溶液中以胶体金的形态存在，亦可在非极性溶剂中形成纳米金，具有许多独特的物理化学特性。金颗粒可以通过弱的相互作用与生物大分子结合，也可以通过化学键与生物大分子偶联而不改变生物大分子的活性。长期以来人们已知纳米金可以与蛋白质、酶、生物素等相结合6。Lewis 等研究发现由于金纳米微粒与氨基和巯基有很强的相互作用7，带有游离氨基和巯基的氨基酸以及蛋白质或酶等生物分子能够直接组装到金纳米微粒的表面8，这种结合能力，主要归功于酶表面自由的氨基或半胱氨酸等残基的巯基与金纳米微粒的特异性结合能力。Kumar9等研究发现，金纳米颗粒表面的 AuCl4-和AuCl2-离子分别与 RNH2 反应生成了Aun(AuCl4-)m(RNH3+)m 与AunAuCl(RNH2)m 两种络合物。金纳米微粒的生物学应用就是利用金纳米微粒与酶游离氨基之间的这种相互作用，将二者组装成具有催化功能的生物复合体。目前，金磁微粒的制备主要采用反胶束法(Reverse Micelle)、自组装技术(Self-assembly technique)、种子生长法(Seed-mediated growth)等方法。本文采用是通过自组装技术进行金磁微球的合成。自组装技术是指分子及纳米颗粒等结构单元在没有外来干涉的情况下，通过非共价键作用自发地缔造成热力学稳定、结构稳定、组织规则的聚集体的过程。自组装技术具有设计灵活，操作简单，能在超分子水平控制壳层的组成结构和厚度等优点，已成为当前化学、物理学、材料学和生物学交叉领域一个令人瞩目的技术，在组装各种不同功能的复合纳米微粒方面具有广阔的应用前景10。金磁微粒自组装技术首先分别合成磁性氧化物粒子和纳米金粒子，由于纳米颗粒具有大的比表面积，纳米粒子往往具有高的表面活性。对于分散在中性水溶液中的 Fe3O4 纳米颗粒，裸露在颗粒表面的 Fe 与 O原子将更易于吸附水溶液中的 OH-，H+离子，从而形成了一个富-OH功能团的表面。例如采用硅烷化试剂在 Fe3O4 纳米颗粒表面与-OH反应则可形成一层氨基功能团。然后通过 Au-S, Au-N 等原子之间的相互作用将纳米金粒子吸附在磁性颗粒表面可形成组装结构的金磁微粒。崔亚丽等5采用 3-巯丙基三乙氧基硅烷对磁性氧化物粒子进行硅烷化修饰，在 Fe3O4 磁性微粒表面进行修饰, 合成得到巯基末端功能化磁性微粒,，将经硅烷化修饰形成的 Fe3O4 聚集体与纳米金粒子相互作用, 制备得到组装型金磁微粒。Caruntu 等11用带氨基的硅烷偶联剂修饰约 10 nm 的 Fe3O4 微粒并使其表面带正电，再与 23 nm 表面带负电的金胶体混合，通过金粒对氨基的强吸附力和静电作用，得到金磁微粒。制得的金磁微粒的突出特点在于可以在外加磁场的作用下定向移动。微粒本身具有较高的磁响应性, 提高磁响应性最简单的方法是制备大粒径的金磁微粒。微粒粒径增大, 其比表面积将降低, 蛋白质、酶等物质在其表面的吸附量将减少, 而且在实际操作应用过程中易沉降, 而小粒径的金磁微粒虽具有高的比表面, 但其磁分离需较高的外加磁场，因此，金磁微粒制备的目标是获得高磁响应性、高比表面、低密度、单分散的微粒。另外，由于铁氧磁性纳米微粒表面能较大，处于高度的热力学不稳定状态，它通过微粒之间的强磁偶极矩的相互作用，有相互聚集使系统自由能降低的趋势。某些纳米磁性微粒如 Fe、Fe3O4 微粒在空气中极易被氧化，导致微粒变性，而且磁性纳米微粒表面的功能基团少，功能单一。针对以上在合成金磁微球过程中出现的问题，本实验通过控制胶体金的粒径和结合数量来制备适当粒径的的金磁微球，并且采用表面包覆制备纳米复合微粒的方式来克服磁性纳米微粒自身的缺点，通过硅烷化试剂 APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）对 Fe3O4 微粒表面进行氨基化修饰，从而改进、提高和增加磁性纳米微粒的性能。1 实验材料1.1 实验药品FeSO4（AR 成都科龙化工试剂厂） 、Fe2(SO4)3（AR 成都科龙化工试剂厂） 、NaOH（AR 成都东金化学试剂有限公司） 、柠檬酸三钠（AR 重庆东方试剂厂） 、HAuCl4（AR 国药集团化学试剂有限公司） 、APTES（AR AIDRICH） 、95%无水乙醇（AR 成都科龙化工试剂厂）1.2 实验仪器电子天平 BT-124S（北京赛多利斯仪器系统有限公司） 、恒温水浴锅HH-64（金坛市富华仪器有限公司） 、电动搅拌器 RW 20DZM.n（Kika labortechnik） 、超声波细胞粉碎机 JY96-II（上海申源科学仪器有限公司） 、真空干燥箱 DZF-6090（上海精宏实验设备有限公司） 、酸度电势测定仪 PH-3V（南京桑力电子设备厂） 、透射电子显微镜 JEOL H600（日本电子公司） 、振动样品磁强计 MPMS XL（美国 Quantum Design 公司） 、可见光分光光度计 UV-2000（上海尤尼柯仪器有限公司） 、原子吸收分光光度计 IRIS Advantag（美国 Thermo Electro公司）2 实验方法2.1 制备水相分散的 Fe3O4 微粒（化学共沉淀法）将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定比例混合，将碱性沉淀剂快速加入至上述铁盐混合溶液中，搅拌、反应一段时间即得纳米级 Fe3O4粒子，总反应式为：Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- Fe3O4 + 4H2O理论摩尔比 n (Fe2+)：n (Fe3+)：n (OH-)=1：2：8称取 NaOH 固体 16.000 g，用总计 100 mL 蒸馏水充分溶解转移至四颈瓶中，在 63 水浴条件下不断搅拌 300 r/min，接入冷凝管封闭同时通入 N2 保护。称取 2.780 g FeSO4?7H2O，3.9988g Fe2(SO4)3?9 H2O，用 56 mL 蒸馏水充分溶解，缓慢将 Fe2+，Fe3+混合溶液注入四颈瓶中，转速提高到 450 r/min，恒温水浴 30 min，得Fe3O4 黑色沉淀。待冷却至室温后，在外加磁场分离作用下，将所得沉淀用双蒸水清洗 6-8 次，制得 Fe3O4 微粒进一步超声分散 5 min，即得水相中分散的 Fe3O4 微粒。进一步取 5 mL 样品放入真空干燥箱中