分子生物学基础实验分子生物学基础实验 实验一实验一 质粒质粒 DNA 的小量制备的小量制备一、实验原理一、实验原理载体:要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector） 。载体的设计和应用是 DNA 体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体 DNA 链上有 1 到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr） ，抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1120kb 之间，具有双链闭合环状结构的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control） 。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在 20 个以上。通常大的质粒如 F 因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如 ColE 质粒（含有产生大肠杆菌素 E1 基因） ，拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，染色体 DNA 复制受阻，而松弛型ColE质粒继续复制 1216h，由原来 20 多个拷贝可扩增至 10003000 个拷贝，此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量由原来的 2增加到 4050。质粒 pBR322、pUC19 就是由 ColE 衍生的质粒。所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒 DNA。质粒 DNA 的相对分子量一般在 106107范围内，如质粒pBR322 的相对分子质量为 2.8106，质粒 pUC19 的相对分子质量为1.7106。在细胞内，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环 DNA（open circular DNA，简称 ocDNA） 。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和线状 DNA 的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒 DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带。二、实验目的二、实验目的 1掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法。 2了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌 E.coli，质粒 pegf。试剂：1. LB 培养基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH 调 pH 至 7.3 左右。如固体培养基则添加 15g/L 琼脂。2. 溶液（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。3. 溶液（0.2mol/LNaOH(内含 1SDS)）：预先配制 1SDS 母液，临用前一天晚上加入 0.2mol/LNaOH，4保存。4. 溶液（pH4.8 乙酸钾溶液）：5mol/L 乙酸钾 60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水 28.5mL。5. 酚/氯仿液(V/V1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为 24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的 0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4保存。 6. 无水乙醇7. 70乙醇8. pH8.0 TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA 酶 20g/mL。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP 管(1.5mL 微量离心管)、加样器(20uLlmL)、吸头。四、操作步骤四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒 pegf 的大肠杆菌接种在含 50g/mL 卡那霉素(Ka+)的 LB 液体培养基中，37振荡培养过夜。注意：添加 Ka+时，须待LB 培养基冷却到 50左右方可加入。（二）从菌落中快速提取制备质粒 DNA1取 1.5mL(750uL 取两次)菌液置于 1.5mL Ep 管中，10000rpm离心 3min。2弃上清，重复步骤 1，弃上清，加入 150L GET 缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀。3加入 300L 新配制的 0.2mol/L NaOH(内含 1SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）3 次，使之混匀。4加入 225L 冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒（不要振荡）3 次使之混匀。510000rpm 离心 5min，上清液吸至另一干净的 1.5mL Ep 中，如上清液浑浊则需重新离心一次。6于上清液中加等体积氯仿，振荡混匀， 10000rpm 离心 5min，小心吸取上清液，转移至另一支 1.5mL Ep 管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7向上清液加入 2 倍体积无水乙醇，混匀，用离心机于 10000rpm离心 5min。小心吸去上清液。8用 0.5mL 70乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm 离心 5min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。9用 20uL TE 重新溶解 DNA，置于 4保存，供电泳使用。贮存于-20备用，可长期保存。实验二实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定的含量、纯度与分子量的电泳法测定一、一、 实验原理实验原理测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。1紫外分光光度法DNA 或 RNA 定量时，应在 260nm 和 280nm 两个波长下读数。根据计算在 260nm 波长下，每 1ug/mL DNA 钠盐的 A 值为 0.20，即在 A260=1 时，双链 DNA 含量为 50ug/mL，单链 DNA 与 RNA 含量为 40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为 33 ug/mL。双链 DNA 含量A26050稀释倍数（ug/mL）RNA 含量A26040稀释倍数（ug/mL）单链 DNA 含量A26033稀释倍数（ug/mL）此外还可以根据 260nm 和 280nm 的读数间的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。2琼脂糖凝胶电泳法根据 DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用 EB 嵌入 DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表 21 作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要 510ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测 DNA 样品。表 21 DNA/ Hind 中 DNA 片断二、实验目的二、实验目的 1从以上实验中提取到的质粒 DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定 DNA 的纯度、含量以及分子量大小。2本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测 DNA、含量与相对分子质量大小。三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂材料：自制的质粒 DNA、DNA/ Hind 、 。试剂：1标准 DNAmarker(DNA/ Hind )2限制性内切酶 Hind和 10X 缓冲液3酶反应中止液：0.2 5溴酚蓝(含 40蔗糖)，已配好。4溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释 1000 倍，母液已配好。注意：EB 是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。50.5TBE 缓冲液：Tris 2.18g、硼酸 1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至 400mL。可配成 5TBE 母液，使用时稀释 10 倍即可。60.7琼脂糖仪器：37水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA 含量/ %DNA 含量/(ng/mg)123.13015.010647.7476.929.4196.1210619.4194.136.5574.2610613.5135.244.3712.84106989.952.3221.511064.847.962.0281.321064.241.870.5640.371061.111.680.1250.081060.32.6Eppendorf 架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep 管(1.5mL)、加样器(20uLlmL)、吸头。四、实验操作四、实验操作（一）质粒 DNA 的酶解1新提的质粒，在 10uL 的体系中用单一酶（如 EcoR）进行处理，即：质粒 DNA 2L10缓冲液 1LEcoR 0.5LddH2O 6.5L 237，保温 30min。3加入 1/10 体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。（二）琼脂糖凝胶板的制备1琼脂糖凝胶的制备称取 1.0g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100mL TBE 缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为 1。2胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至 65左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置 1h 左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入 0.5TBE 电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小槽3加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为 10uL 左右。4电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA 片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于 5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约 12cm 处，停止电泳。5染色