Y8 9 6 17湖北中医学院硕士学位论文宣肺定喘汤对哮喘大鼠气道重构和炎症 介质抑制作用的实验研究研究生姓名：指导教师姓名、职称：学科、专业名称：研究方向：蒋跃文李家庚教授中医临床基础伤寒论经方的临床应用及实验研究二0 0 六年五月宣肺定喘汤对哮喘大鼠气道重构和炎症介质抑制作用的实验研究俩十学位论文E U S AH EB A L FS P S SE O Sl g El C A M 1缩略词表E n z y m el j n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附试验H e m a t o x y l i n ea n de o s i n苏木素伊红B r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d肺泡灌洗液s t a t j s t i c a lp r o 芦锄f o rs o c i a ls c i e n c e社会科学统计程序E o s i n o p h i l sI m m u n o g l o b u I i nE嗜酸粒细胞免疫球蛋白EI n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e 1细胞间粘附分子1B AB r o n c h i a la s t h m a支气管哮喘B H RB r o n c h i a lh y p e 丌c a c t i v i t y气道高反应性E n d o t h e l i n内皮素P A FP 1 a t e l e ta c t i b a t i gf a c t o r血小板活化因子I T SL e u k o t r i e n e 8白细胞三烯G M c s FG r a I l u l o c y t i cm a c r o p h a g e粒细胞一巨噬细胞集落I N F rT G F 一0c o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o 。I n t e r ：I c r o n r刺激因子r 干扰素T r a n s f 0 瑚i n gg m w t hf a c t o r - B转化生长因子p宣肺定喘汤对哮喘人鼠气遭重构和炎症介质抑制作用的实验研究硕士学位论文中文摘要目的 宣肺定喘汤是导师在多年临床实践基础上，总结治疗哮喘经验而成的效方。 本方为小青龙汤的加减方，其在伤寒论及金匮要略均有论述。小青龙汤 适用用于外寒内饮的哮喘病证，其组方遵循了宣肺化饮、止咳平喘的治疗原则， 为治疗哮喘之良方。本实验旨在探讨宣肺定喘汤对哮喘大鼠气道重构和炎症介质 的抑制作用，为经方防治哮喘的研究开辟一条新途径，并为开发宣肺定喘汤作为 平喘药物提供客观依据。同时在哮喘的中医药治则理论、复方哮喘药理的现代研究方面均具有一定的实践意义。 方法 通过文献研究考察小青龙汤治疗哮喘的现状，并以此为基础，通过实验初步 揭示宣肺定喘汤对气道重构和炎症介质的抑制作用，具体方法如下： 1 、宣肺定喘汤对哮喘大鼠支气管和肺组织形态学的影响的研究，采用光学 显微镜观察哮喘大鼠肺组织形态学的改变；运用医学图文分析系统分析，测量支 气管基底周径( P b m ) 、总管壁面积( w A t ) 、内壁面积( w A i ) 及平滑肌面积( w A m ) ， 并用P b m 将测量值标准化，分别用w A t P b m 、w A i P b m 、w A m P b m 表示相应管壁 各层底厚度，观察哮喘大鼠肺组织气道重构的情况。 2 、运用细胞记数法观察宣肺定喘汤对哮喘大鼠肺泡灌洗液( B A L F ) 、外周血 炎性细胞水平的影响。 3 、运用放射免疫法观察宣肺定喘汤对哮喘大鼠外周血中I 班表达水平的影响。 4 、运用E L I s A 法和免疫组化法观察宣肺定喘汤对哮喘大鼠肺泡灌洗液 ( B A L F ) 及肺组织中E o t a x i n 表达水平的影响。 5 、运用E L I s A 法和免疫组化法观察宣肺定喘汤对哮喘大鼠肺泡灌洗液 ( B A L F ) 及肺组织中I c A M 一1 表达水平的影响。结果 1 、通过光镜对宣肺定喘汤大、中、小剂量组大鼠肺组织切片的观察，发现 宣肺定喘汤能明显缓解哮喘时肺组织内以嗜酸粒细胞为主的炎性细胞的浸润，且 支气管壁的平滑肌增厚和炎性渗出物的增多都明显轻于病理模型经。宣肺定喘汤 大、中、小剂量组肺组织切片w A t P b m 、w A i P b m 、w A m P b m 各项数值与病理模 型组相比有显著的差异( P o 0 5 ) ；大剂量组同中剂量组相比，有显著差异( Pc0 0 5 ) ；中剂量组同小剂量组无显著差异( P o 0 5 ) 。 3 讨论1 9 92 年哮喘“气道重构( a i r w 8 yR e m o d e l i n gr 的概念被H u b e r 等”明确提出。到目前为止，“气道重构”的定义主要是以组织学上的描述为主，它包括气 道壁的增厚，上皮下纤维化，平滑肌细胞的肥厚、增殖，肌成纤维细胞的增殖及 粘液腺和杯状细胞的增生及化生“1 。这种组织学异常的发生机制及其对气道生理 功能的影响尚未被人完全了解，各家的结论也不尽一致。目前有代表性的学说之 一是“损伤一修复学说”。由于在某种程度上哮喘的特征就是气道炎症，人们因此宣肺定喘汤对哮喘人鼠气道重构和炎症介质抑制作用的实验研究硕十学位论文推测气道重构就是在炎症基础上的损伤修复过程。正常情况下，受损伤的气道可 以通过修复机制愈合，从而保持组织的完整性。在疾病状态下，如过敏性气道炎 症，可以使这种损伤一修复机制发生紊乱，从而导致一些有促有丝分裂活动性的 介质及因子的释放。他们刺激平滑肌细胞及成纤维细胞，使气道壁纤维组织增生，平滑肌增厚”1 。B o s k e n 等”1 发现外周气道炎症与气道壁厚度成正相关，并且两者 均与气流阻塞相关。T i d d e n s “1 发现哮喘患者的大、中气道内膜层的厚度与炎症 反应相关。这些均证实了炎症在气道重构中的作用。由表1 我们可以看出宣肺定喘汤大、中、小剂量组w A t P b m 、w A i P b m 、w A m P b m 各项数值与病理模型组相比有显著的差异( PcO 0 5 ) ，说明宣肺定喘汤能有 效抑制哮喘大鼠肺组织平滑肌增厚及气道壁纤维组织增生，它的机制可能通过抑 制肺组织内炎性介质及因子的释放，从而影响哮喘大鼠的气道重构。宣肺定喘汤 大剂量组与地米组相比，无显著差异性( P 0 0 5 ) ；各宣肺定喘汤组间比较，提示4 9 m l 是三个剂量中的最佳用量。 通过光镜下对哮喘大鼠支气管及肺组织病理切片的的观察，发现宣肺定喘汤 能明显减少炎性细胞的浸润，肺泡壁水肿及支气管平滑肌的增厚。从病理组织学 的角度上，说明宣肺定喘汤能缓解哮喘症状的发作。参考文献【1 】s a n t i n gR E ，0 l y m u l d e rc G ，z a a g s m aJ ，e ta 1 R e l a t i o n s h i p s锄o n ga l l e F g e n i n d u c c de 盯l y1 a t ep h a s ea i n a yo b s t r I l c t i o n s ，b r o n c h i a lh y p e 玎e a c t i V i t y a 们i n n a m m a I i o ni nc o n s i c i o u s ，u n r c s t I a i n e dg u i n c ap i g s 吲J 趟l e r g yc l i nI m m u n o l ，1 9 9 4 ，9 3 ( 6 ) ：1 0 2 1 2 】迟磊，符州，等过敏性哮喘大鼠模型的建立 J 重庆医学，2 0 0 3 ，3 2 ( 4 ) ：4 2 9 4 3 1 3 1H u b e rP ，K o e s s l e rL ，e ta 1 A c u t es e v e r ea s t h m ai I Ip e d i a t r i cr e s u s d t a t i o n T h cF r e n c hs t u d y G r o u po nP e d i a t r i cR e s u s c i t a t i o n m c hP e d i c l r ，1 9 9 4 ，1 ( 4 ) ：3 4 6 3 4 9 4 E l i a sJ A A i r w a yr e m o d e l i n gi na s t h m au n a n s w e r e dq u e s t i o n s 【J 】A I l lJR e s p i rC r i tC a r eM e d ，2 0 0 0 ，1 6 1 f 3 1 ：1 6 8 1 7 1 _【5 】B o s k e nC H ，w i g g sB R ，P a 琵P D ，e ta 1 s m a l la j 刑a yd i m e n s i o n si ns m o k c T sw i t ho b s t n l c t i o t oa i m o w 【J 1 A mR e vR e s p j rD i s ，1 9 9 0 ；1 4 2 ；5 6 3 5 7 0 6 1T i d d e n sH ，S i l v e m a nM ，B u s hA T h er o l eo fi n n 砌m a t i o ni na i n a yd i s e a s e R e m o d e l l i g J 1 A mJC r i tC a I 弓M e d ，2 0 0 0 ，1 6 2 ：7 1 0 9宣肺定喘汤对哮嗝人鼠气道重构和炎症介质抑制作用的实验研究硕士学位论史2 宣肺定喘汤对哮喘大鼠血及支气管肺泡灌洗液炎性细胞的影响本实验通过观察哮喘大鼠血液和肺泡灌洗液中炎性细胞的变化，来探讨其平 喘和抑制炎性细胞增生的作用。 1 材料与方法 1 1 实验动物同实验1 。 1 2 主要仪器及试剂 E D T A N a 2 ，北京科美东雅生物技术有限公司，批号：0 5 03 1 0 。T G L 一16 6 型低温离心机：上海安亭科学仪器厂；细胞记数板。余同实验l 。 1 3 药物组成与制备 同实验1 。 1 4 分组给药及造模 同实验1 。1 5 取材 末次雾化引喘2 4 小时后，取2 戊巴比妥纳作腹腔注射麻醉大鼠，结扎左肺， 支气管插管，右肺行支气管肺泡灌洗。每次每只大鼠注入生理盐水2 m l ，灌洗2 3 次，收集4 6 m 1 灌洗液。心脏取血3 m 1 ，加入抗凝剂E D T A N a 2 ，混匀。 1 6 指标观察 1 6 1 大鼠引喘时症状观察 观察大鼠诱发哮喘时的表现。1 6 2 大鼠肺泡灌洗液及血液细胞记数 取支气管肺泡罐洗液( B A L F ) 0 1 m 1 ，细胞记数板计数，其余B A L F1 2 0 0 r p m m i n ， 1 0 m i n 离心，沉淀物涂片，分类计数；取1 滴血涂片，分类计数。 2 结果2 1 症状观察 哮喘时大鼠出现抖毛，点头式呼吸，呼吸加深加快，肋间隙凹陷，腹部肌肉 明显收缩等表现，但宣肺定喘汤大、中小剂量组大鼠哮喘发作时症状表现的程度都要比病理模型组轻。 2 2 1 肺泡灌洗液细胞记数。 表2 对致敏大鼠支气管肺泡灌洗液炎性细胞的影响( x s ) 1 0 8 酬搿泛瑟。k 。x 。；0 8 )空白对照组1