I IS SS SR R 在在中中药药材材研研究究中中的的应应用用【摘 要】 通过介绍 ISSR 技术的原理和特点, 阐述了 ISSR 技术在中药材的种 质资源鉴定、遗传多样性和遗传结构等方面的研究进展。 【关键词】 ISSR; 中药材; 种质研究近年来, DNA 分子标记技术的研究日渐成熟, 其应用也日益广泛。目前, 各 种分子遗传标记技术在药用植物中的应用已深入开展, 为药用植物的鉴定和 DNA 指纹图谱的建立、基因的定位与克隆、和分子标记辅助育种等遗传研究提 供了有价值的工具。目前常用的分子标记有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR 等。其中 ISSR 标记以其特异性的扩增、良 好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点 1, 被视为理想的遗传标记方法。 简单重复序列间扩增 (ISSR)是一种在简单重复序 YU(SSR)基础上发展起 来的新型的分子标记，由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz 等(1994)提 出。该技术以锚定的微卫星 DNA 为引物，在 SSR 序列的 3或 5端加锚 24 个随机核苷酸，在 PCR 反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导 致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA 片断进行 PCR 扩增。所 扩增的 InterSSR 区域的多个条带可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖 凝胶电泳得以分辨 (周延清，2005)。现己广泛应用于 中药材种质资源鉴定、 进化与亲缘关系分析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定 位、分子标记辅助育种等方面的研究。 1 ISSR 技术原理和特点 ISSR (inter- simplesequence repeat) 即简单重复序列间扩增, 是一种建立在 PCR 反应基础上的新型的分子标记,由加拿大蒙特利尔大学的 Zietkiewicz 等于 1994 年提出的2。它结合了随机引物扩增多态 DNA ( random amp lified pdymorphic DNA, RAPD) 和简单重复序列( simplesequencerepeat, SSR) 标记技 术的优点, 与以往的分子标记相比,能够提供更多的基因组 DNA 信息。 真核生物基因组中广泛存在着由 14 个碱基对组成的简单重复序列, 又称 微卫星(microsatellite)。ISSR 分子标记就是用锚定的微卫星 DNA 为引物, 在 SSR 序列的 3, 或 5 端加上 24 个随机核苷酸, 在 PCR 反应中, 锚定引物 可以引起特定位点退火, 导致锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA 片 断进行 PCR 扩增。所扩增的 Inter - SSR 区域的多个条带可通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨3。由于 SSR 一般是以短的(16bp) 基元 组成的较低程度的串联重复, 在基因组的许多位点都有分布, 占据基因组的绝大 部分, 并且进化变异速度快, 因而 ISSR 可检测到基因组中许多位点的变异4, 较其它标记方法多态性更好。 ISSR 标记技术试验操作简单、快速、高效, 不需要繁琐地进行基因文库构 建、杂交和同位素显示等步骤; 重复序列和锚定碱基的选择是随机的, 无需知道 任何靶标序列的 SSR 背景信息, 从而降低了技术难度和实验成本; 无需活材料, 无组织器官特异性, 能实现全基因组无编码取样;采用了较长的引物(1524bp) , 退火温度较高, 因此, 引物具有更强的专一性, 增强了实验的可重复性。但 ISSR 标记在 PCR 扩增时需要一定的时间摸索最适反应条件。2 ISSR 技术的应用 21 种质资源的鉴定 我国虽有丰富的中草药资源, 但由于应用区域、历史传承、民间方言等客 观原因, 加上缺乏系统的整理, 致使中药材同名异物、同物异名的现象特别多; 中药商品市场混乱, 多有以假充真, 以次充好的情况; 随着人们“回归自然”的 迫切需求, 中药需求量的日益扩大, 资源矛盾日趋尖锐。而 ISSR 技术能够快速 有效地鉴别中药材正品, 很好地解决了这些问题。 沈颖等5采用 ISSR 技术对石斛属 9 种植物进行了石斛种间鉴别, 很好地解 决了名贵中药材石斛的种类繁多、鉴别困难的问题。周晔等6采用 ISSR 技术 鉴别了中药黄精及其主要掺伪品卷叶黄精, 两者外形上很难区分, 从分子水平上 可以很好地鉴别。潘清平等7用 ISSR 的技术对玉竹不同品种进行了鉴定, 有效 区分了玉竹栽培品与野生种及易混淆品黄精的不同, 为玉竹商品药材的鉴定提 供了分子学上的依据。 ISSR 技术不会受到环境因素的影响, 因此在中药材真假品种的鉴定和道地 药材的鉴别上有很大的优势。22 种质遗传多样性和遗传结构 ISSR 技术在种质资源的研究中最主要的应用是分析和评估种群的遗传多样 性。物种的遗传多样性是长期进化的结果, 也是其生存和发展的前提。对物种 遗传多样性和遗传结构的研究, 是探讨其适应性、生存力的基础。由于 ISSR 技 术能提供较大数目的 DNA 片段, 可以扫描基因组内的多态位点, 因而是一种用 于分析物种、种群、不同品系,甚至是个体间遗传差异的理想方法8。通过进一 步的相关分析、聚类分析等数量遗传分析可进行不同亲缘物种间的遗传聚类的 划分, 这种划分可反映出与地理分布的相关性,确定是否呈现一定的地域性, 从 而为这些物种的保护、可持续利用奠定理论基础。 罗群等9对江油附子和 9 个野生居群的附子进行了遗传多样性分析, 结果 表明 10 个居群的遗传一致性较高, 分化较少, 而且江油附子和 9 个野生川乌居 群具有遗传差异性。徐红等10对 11 个不同产地的丹参药材亲缘关系进行了分 析, 结果表明不同产地的丹参药材间遗传分化明显,具有丰富的遗传多样性, 但 是遗传分化与地理关系没有表现出相关性。袁菊红等11利用 ISSR 技术对石蒜 属 4 种植物的种间亲缘关系和同一种内不同采集地材料的遗传多样性进行了分 析, 结果表明 4 种石蒜属植物具有丰富的种内遗传多样性。3 展望 ISSR 标记技术在药用植物种质资源研究中发挥了重要作用。当然 ISSR 标 记亦存在一些缺点, 限制了其在某些方面的应用。目前 ISSR 技术主要应用于农 作物、果树、林木等方面的研究, 在药用植物方面的应用相对较少。ISSR 标记 以其多态性高、可重复性强、简便快速等优势, 必将使其在药用植物“道地性” 基因定位、道地药材机制、中药品质与标准化、濒危珍稀动植物保护与利用等 方面发挥更大的作用。参考文献 1 罗群, 马丹炜, 王跃华. 川芎遗传多样性的 ISSR 鉴定J. 中草药,2006, 10: 4. 2 Xiao XH, Liu FQ, YuanHL, et al. Anoutlookon the authenticationof Traditional ChineseDrug (TCD) by DNA molecular marker J . Chin Tradit HerbDrug, 2003, 31 (8): 561- 565. 3 Zhou YQ. Application of DNA Molecular Markers Technique to Plant Research (DNA 分子标记技术在植物研究中的应用) M. Beijing: Chemical Industry Press, 2005. 4 沈洁. DNA 序列、ISSR 标记在药用植物种质鉴别中的药用D. 生命科学学 院, 2005: 3. 5 沈颖, 徐程, 万小凤等. ISSR- PCR 在石斛种间鉴别中的应用J.中草药, 2005, 36 (3): 423- 424. 6 周晔, 王润玲, 唐铖等. ISSR 法鉴定中药黄精与卷叶黄精J. 天津医科大学 学报, 2006, 12 (2): 178. 7 潘清平, 周日宝, 陈玉秀等. 玉竹不同品种的 ISSR 分子鉴定J. 中国现代中 药, 2008, 10 (10): 28- 30. 8 王明明, 宋振巧, 王建华. ISSR 标记技术及其在药用植物遗传育种中的应用 J. 中草药, 2007, 38 (1): 134- 136. 9 罗群, 马丹炜, 王跃华. 川乌遗传多样性的 ISSR 鉴定J. 中草药,2006, 37 (10): 1554- 1557. 10 徐红, 王燕燕, 魏丹红等. 不同产地丹参药材的 ISSR 分析与鉴定J. 中药 新药与临床药理, 2007, 18 (6): 454. 11 袁菊红, 孙视, 彭峰等. 石蒜属植物遗传多样性的 ISSR 和 RAPD 标记比较 研究J. 中草药, 2007, 38 (10): 1555.