质粒DNA 小量提取试剂盒一、产品简介 采用SDS 碱裂解法，结合硅胶膜选择性吸附DNA 的方法，适合1-4ml 细菌培养物中提取多至20 g 质粒DNA。 纯化的质粒DNA 适合用于酶切、PCR、测序、转化和转染等分子生物学实验。 二、试剂盒组成和储存组成内容DBI-2011 (50次) DBI-2012 (200次) RNase A1 30 l 120 lBuffer BL 15 ml 60 ml Buffer P1 15 ml 60 ml Buffer P2 15 ml 60 ml Buffer P3 20 ml 90 ml Buffer WA 19 ml 75 ml Buffer WB 16 ml 65 ml DNA 吸附柱-B 50 套200 套 1.5 ml 离心管50 个200 个TE 15 ml 30 ml 说明书 1 份 1 份RNase A1: 50 mg/ml, -20长期保存；第一次使用前将RNase A1全部加入Buffer P1中，于 4保存。 Buffer WA和Buffer WB，使用前按试剂瓶所示体积加入无水乙醇或者95%乙醇，混合均匀。 TE：10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0(25C)。 除RNase A1和Buffer P1(已加入RNase A1)外，其他组成成分于室温储存。 三、注意事项 1. Buffer P3 和Buffer WA 含刺激性化合物，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛， 立即使用大量水或生理盐水冲洗沾染处，必要时寻求医疗咨询。 2. 使用后应及时盖紧试剂瓶盖子，以免影响下次使用效果。 3. 操作步骤A2 和B2，充分悬浮细菌，无可见的块状菌团，不然会影响裂解效果。 4. 操作步骤A3 和B3，缓慢翻转离心管，以免机械力打断基因组DNA 而导致最后纯化的质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染，同时避免打断质粒DNA，保持其完整性。 5. 操作步骤A3 和B3，溶液呈透亮后，需立即加入Buffer P3，避免质粒DNA 长时间暴露于Buffer P 2（含NaOH， 强碱性环境）中完全变性为单链DNA 后无法复性恢复为超螺旋状态。 6. 操作步骤A4 和B4，形成紧实的大团状凝集物前需缓慢摇晃离心管，避免机械力打断基因 组DNA 和质粒DNA； 之后快速剧烈摇晃3 次将凝集物打散，有助于充分释放质粒DNA，从而提高产量。 7. 操作步骤5，室温放置1-2 min，有助于提高DNA 吸附效率，从而提高产量。 8. 操作步骤 10，室温放置 1-2 min，有助于提高 DNA 洗脱效率，从而提高产量。 四、操作步骤 平衡DNA 吸附柱(此步骤可提高硅胶介质吸附DNA 效率，可在使用本试剂盒当天任何时间操作)在DNA 吸附柱-B（置于2 ml 离心管中）中加250 l Buffer BL，室温12,000g 离心1 min， 弃废液，将DNA吸附柱-B 放回2 ml 离心管中。 根据菌量选择方法A 或者B 提取质粒DNA 从2109 细菌中提取质粒DNA，请选择方法A. 从少量细菌中提取质粒DNA。 从2109-4109 细菌中提取质粒DNA，请选择方法B. 从常规数量细菌中提取质粒DNA； 培养至OD600 为1-1.5，此时1 ml 菌液中约含1.0109 细胞。从1-2 ml 菌液中提取质粒DNA 按照方法A 操作，从2-4ml 菌液中提取质粒DNA 按照方法B 操作。 如果细菌生长状态不佳，视离心收集后细菌沉淀体积选择提取质粒DNA 的方法。估算细 菌沉淀体积，细菌沉淀体积30 l 按照方法A 操作，细菌沉淀体积30 l 按照方法B 操作。 方法A 可以减弱Buffer P2（含NaOH，强碱性环境）对质粒DNA 的变性作用，减少质粒DNA 完全变性为单链DNA 后无 法复性恢复为超螺旋状态的比例。A. 从少量细菌中提取质粒DNA 实验准备：第一次使用前，将试剂盒携带的RNase A1 全部加入Buffer P1 中。 检查Buffer P2 是否析出白色沉淀，如有沉淀在37放置数分钟，沉淀溶解后恢复至室温使用。 A1. 用干净的1.5 ml 离心管，室温12,000g 离心1 min 收集2109 细菌；弃尽上清。 A2. 加入 100 l Buffer P1（含 RNase A1）， Vortex 震荡或者用 Tips 充分悬浮细菌。 A3. 加入100 l Buffer P2，缓慢翻转离心管混合均匀，直至溶液呈浅黄色透亮状。 A4. 立即加入140 l Buffer P3，缓慢翻转离心管混合均匀，形成紧实的大团状凝集物后 （约摇晃15 次），快速 剧烈摇晃3 次使凝集物呈松散状；室温12,000g 离心5 min。 如果离心上清中有漂浮的凝集块，快速摇晃3 次后再次离心。继续操作步骤5.B. 从常规数量细菌中提取质粒DNA 实验准备：第一次使用前，将试剂盒携带的RNase A1 全部加入Buffer P1 中。 检查Buffer P2 是否析出白色沉淀，如有沉淀在37放置数分钟，沉淀溶解后恢复至室温使用。 B1. 用干净的1.5 ml 离心管，室温12,000g 离心1 min 收集2109-4109 细菌；弃尽上清。B2. 加入250 l Buffer P1（含RNase A1）， Vortex 震荡或者用Tips 充分悬浮细菌。 B3. 加入250 l Buffer P2，缓慢翻转离心管混合均匀，直至溶液呈浅黄色透亮状。 B4. 立即加入350 l Buffer P3，缓慢翻转离心管混合均匀，形成紧实的大团状凝集物后 （约摇晃15 次），快速 剧烈摇晃3 次使凝集物呈松散状；室温12,000g 离心5 min。 如果离心上清中有漂浮的凝集块，快速摇晃3 次后再次离心。继续操作步骤5. DNA 结合 5. 将步骤 4 中溶液倒入或者用移液器转入 DNA 吸附柱-B 中（勿转入管底沉淀），室温放置1-2 min。 6. 室温8,000g 离心1 min，弃废液，将DNA 吸附柱-B 放回2 ml 离心管中。洗涤 实验准备：第一次使用前，按试剂瓶所示体积在Buffer WA 和Buffer WB 中加入无水乙醇或者95%乙醇。 7. 在DNA 吸附柱-B 中加入500 l Buffer WA，室温8,000g 离心1 min，弃废液，将DNA 吸附柱-B 放回 2 ml 离心管中。 8. 在DNA 吸附柱-B 中加入500 l Buffer WB，室温8,000g 离心1 min，弃废液，将DNA 吸附柱-B 放回 2 ml 离心管中。重复此步骤。9. 室温12,000g 离心2 min。 洗脱 实验准备（可选）：65预热TE 或者去离子水。 10. 将DNA 吸附柱-B 转入试剂盒携带的1.5 ml 离心管中，向DNA 吸附膜的中央加50-200 l TE 或者去离子水， 室温放置1-2min，室温12,000g 离心1 min。65预热TE 或者去离子水，可以提高洗脱效率。 离心结束后将 1.5 ml 离心管中的洗脱液加到吸附膜的中央，重复此步骤，可以提高洗脱效率。