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题题 目目 乙醇脱氢酶基因的克隆及转接乙醇脱氢酶基因的克隆及转接 _姓姓 名名_邹昊天邹昊天_学学 号号_3120100160_专专 业业_应用生物科学应用生物科学_年年 级级_大三大三_乙醇脱氢酶基因的克隆及转接乙醇脱氢酶基因的克隆及转接一、一、实验背景介绍实验背景介绍 醋酸杆菌在工业生产和日常生活中,都是极为常见而重要的菌种,参与食醋酿造和维 生素 C 制造。在醋酸杆菌氧化乙醇产生乙酸的生化过程中,乙醇脱氢酶是参与发酵的一种 重要酶,其他酶种还包括乙醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等。乙醇脱氢酶分布在醋酸杆菌细胞 膜和细胞质中,但膜蛋白较细胞质酶活性大得多。对于醋酸杆菌来说,细胞膜侧乙醇脱氢 酶最佳 pH 为 4。 乙醇脱氢酶在生物中广泛存在,包括微生物、植物、 哺乳动物等,但微生物,尤其是 醋酸杆菌,胞内具有丰富的乙醇脱氢酶酶系,是克隆乙醇脱氢酶基因的好材料。 在巴氏醋酸杆菌中,乙醇脱氢酶以两个亚基 adh1 和 adh2 组成,因此需要克隆两个基 因,自组装后获得有活性的乙醇脱氢酶。 二、二、实验目的与意义实验目的与意义 本实验的目的是克隆巴氏醋酸杆菌 AC2005 菌株中的乙醇脱氢酶基因,利用电击法将 该基因导入农杆菌,筛选有乙醇脱氢酶活性的农杆菌菌株,并检测乙醇脱氢酶的活力。 本实验的意义在于克隆醋杆菌菌株中的 adh1 和 adh2 基因,由于农杆菌没有乙醇脱氢 酶基因,将醋杆菌的乙醇脱氢酶基因导入农杆菌后,筛选乙醇脱氢酶活性高的农杆菌菌株, 可以帮助在淹水条件下无氧呼吸产生乙醇的植株根系分解乙醇,使植株抗逆性提高。 三、三、材料与方法材料与方法 实验材料:巴氏醋酸杆菌 AC2005、农杆菌 GV3101、pCAMBIA2301-ZH 质粒(含 Kpn I 酶、Sal I 酶、BamH I 酶、Hind III 酶切位点) 实验试剂:PCR 产物回收试剂盒、YEP 固体培养基、YEP 液体培养基、卡那霉素、利 福平、Kpn I 酶、Sal I 酶、BamH I 酶、Hind III 酶、T4 DNA 连接酶、dNTPs、FastPfu DNA 聚合酶、ddH2O、PCR Buffer、引物 P1、P2、P3、P4(序列下述) 、琼脂糖、 EB、TBE 电泳缓冲液、NaCl、TE(pH=7.6;pH=8.0) 、苯酚、氯仿、10 Ligase Buffer、PEG 4000、IPTG、0.05mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH=8.6) 、NAD+、乙醇、 基因组 DNA 提取试剂盒 实验仪器:PCR 仪、摇床、微量移液枪(2.5uL、10uL、100uL、1000uL) 、电泳池、 恒温箱、紫外-可见分光光度计、冰箱、水浴锅等 实验基本流程:提取巴氏醋酸杆菌 AC2005 基因组 DNAPCR 扩增 adh1 基因和 adh2 基因PCR 产物回收凝胶电泳检测特异条带双酶切 PCR 产物和质粒连接质粒和基因 农杆菌活化电击法导入活化的农杆菌,培养检测乙醇脱氢酶活力 实验具体操作流程: a)提取巴氏醋酸杆菌提取巴氏醋酸杆菌 AC2005 基因组基因组 DNA 1. 将 5mL 过夜培养的巴氏醋酸杆菌细胞转移到微量离心管中,12000r/min 离心 3min,收集沉淀下来的细胞。 2. 加 567ul TE 溶液悬浮沉淀,并加 30ul 10% SDS, 3ul 蛋白酶 K(20mg/ml),混匀,37水浴保温 1 小时。 3. 加 100ul 的 5mol/L NaCl,混匀。 4. 加入 80ul CTAB/NaCl 溶液,混匀,65水浴保温 10min。 5. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提,12000rpm 离心 3 分钟。 6. 仔细移取上清液至另一离心管中,加入一倍体积异丙醇,混匀,室温下放置 10min, 即出现絮状 DNA 沉淀。 7. 用勾状玻璃棒捞出 DNA 絮团,在 70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干,室温下干燥后转入 100ul 的 TE 溶液中,DNA 很快溶解于 TE。保存于-20。 b)PCR 扩增扩增 adh1 基因和基因和 adh2 基因基因 乙醇脱氢酶 adh1 的克隆 引物 P1 为 5-CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA-3,下划线为 Kpn I 酶切位点,引物 P2 为 5-ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG-3,下划线 为 Sal I 酶切位点。 PCR 反应体系:DNA 模板 2L;P1(20mol/L)0.5L;P2(20mol/L) 0.5L;dNTPs(2.5mmol/L each)5L;5 Buffer 10L;FastPfu DNA 聚合酶(2.5U/L) 0.5L;ddH2O 补足至 50L。反应条件:95变性 5min;(95变性 50s+50退火30s+72延伸 150s)*30 个循环;72延伸 10min。得到 PCR 产物,4保存。 乙醇脱氢酶 adh2 的克隆 引物 P3 为 5-CGGGATCCGATGATGATGAACAGGCTAAAAACTGC-3,下划线为 Bam H I 酶切位点,引物 P4 为 5-CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA-3, 下划线为 Hind III 酶切位点。 PCR 反应体系:DNA 模板 2L;P3(20mol/L)0.5L;P4(20mol/L) 0.5L;dNTPs(2.5mmol/L each)5L;5 Buffer 10L;FastPfu DNA 聚合酶(2.5U/L) 0.5L;ddH2O 补足至 50L。反应条件:96变性 5min;(96变性 50s+55退火30s+72延伸 80s)*3 个循环;(96变性 50s+57退火 30s+72延伸 80s)*4 个循环; (96变性 50s+59退火 30s+72延伸 80s)*22 个循环;72延伸 10min。得到 PCR 产 物,4保存。 c)PCR 产物回收产物回收 在 PCR 反应液中加入 100L Buffer PCR-A,混匀,转移到 DNA 制备管中,将 DNA 制备管置于 2 ml 离心管中,11000g 离心 2min,弃滤液。 将制备管置回 2 ml 离心管,加 0.7 ml Buffer W2,11000g 离心 12min,弃滤液。 注意确认在 Buffer W2 中加入无水乙醇。 将制备管置于离心管中,将制备管置回 2 ml 离心管,加 0.4 ml Buffer W2,11000g 离心 2 min。 将制备管置于洁净的 1.5ml 离心管中,在 DNA 制备膜正中央加 30l 65去离子 水,室温静置 1 min。11000g 离心 2 min。再加入 10l 65去离子水,11000g 离心 2 min,洗脱 DNA。 d)凝胶电泳检测特异条带凝胶电泳检测特异条带 称取 0.8g 琼脂糖,加入 120mL 1TBE,在微波炉中加热 3min,使琼脂糖完全溶 解。 待溶液稍冷却(手触摸不烫) ,加入两滴 EB,混合均匀,倒在大槽凝胶板上。 待溶液完全凝固,小心拔出梳子,取下凝胶板,去除背面多余的凝胶,将凝胶板 置于电泳仪中,使电泳液完全没过凝胶。 取 4L PCR 产物,加 0.2L Buffer,在各点样孔中加 4L 混匀溶液,在最右的点 样孔中加入 2L Marker。 设置电压为 140V,时间为 30min,电流 120mA。开启电泳仪。 待电泳结束后,小心取出凝胶,放入紫外自显影台板中,获得条带。 e)双酶切双酶切 PCR 产物和质粒产物和质粒 在 1.5mL 离心管中加入 5L 质粒、1L 10Buffer、0.2L Kpn I、0.2LSal I、3.6L 去 离子水,混匀,在 37培养箱中酶切 30min。标记为 1 号管。 在 1.5mL 离心管中加入 5L PCR 产物、1L 10Buffer、0.2L Kpn I、0.2LSal I、3.6L 去离子水,混匀,在 37培养箱中酶切 30min。标记为 2 号管。 在 1.5mL 离心管中加入 5L 质粒、1L 10Buffer、0.2L Bam H I、0.2L Hind III、3.6L 去离子水,混匀,在 37培养箱中酶切 30min。标记为 3 号管。 在 1.5mL 离心管中加入 5L PCR 产物、1L 10Buffer、0.2L Bam H I、0.2L Hind III、3.6L 去离子水,混匀,在 37培养箱中酶切 30min。标记为 4 号管。 f)连接质粒和基因连接质粒和基因 取 1 号管 1L 溶液,与 2 号管 1L 溶液混匀,加入 1L 10 Ligase Buffer,1L 50% PEG 4000,1L T4 DNA Ligase,加无菌水到 10L,16过夜连接。 取 3 号管 1L 溶液,与 4 号管 1L 溶液混匀,加入 1L 10 Ligase Buffer,1L 50% PEG 4000,1L T4 DNA Ligase,加无菌水到 10L,16过夜连接。 g)农杆菌活化农杆菌活化 1)挑取单菌落 GV3101,接种于 5mL 附加有 50mg/L 的利福平的液体 LB 培养基中,28,200rpm,过夜; 2)取 2mL 培养物至 50mL 液体 LB 培养基中,继续培养至 OD600 为 0.5 左右; 3)将培养物冰浴 30min,4,5000rpm,离心 5min,弃上清; 4)用 l0mL 0.lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体;5)4,5000rpm,离心 5min,弃上清; 6)1 mL 20mmo1/L 冷的 CaCl2悬浮,分装成 50L/管,液氮速冻后,-80保存。 h)电击法导入活化的农杆菌,培养电击法导入活化的农杆菌,培养 1.0.2cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟,待其沥干水 分,正置 5 分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶 离冰面 0.5cm 以方便盖上杯盖,冰中静置 5 分钟充分降温。 2.取-80保存的农杆菌感受态插入冰中 5 分钟,待其融化,加入 5L 质粒 DNA, 用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用 200ul 枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中, 盖上杯盖,空管保留待用。 3.启动电转仪,设置参数:C=25F,PC=200ohm,V=2400V,将电击杯快速放入电 转槽中,电击完成快速插入冰中,加入 700l 无抗生素的 LB 并转移到感受态空管中,28振荡培养 23 小时。 4. 6000rpm 离心一分钟收菌,留取 100l 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于 50g/ml 卡那霉素 YEP 平板上,倒置放于 28培养箱培养 2 天。 i)检测乙醇脱氢酶活力检测乙醇脱氢酶活力 1、 挑取克隆的菌落,接种于 YEP 液体培养基上,28 250rpm 培养至 OD600到 0.6, 加入 IPTG 至终浓度为 1mM,进行诱导表达。 2、 6000rpm 离心收集菌体。 3、 5 mL 酶活测定体系中包含 0.05 mol/L 甘氨酸-氧氧化钠缓冲液(pH
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