文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码1/71.目的建立高效液相色谱法检测操作规程。2.适用范围本规程适用于高效液相色谱法试验。3.编制依据药品生产质量管理规范（1998 年修订） 国家药品监督管理局（1999）4.责任4.1 QC 质检员对本规程的实施负责。4.2 QC 主管对本规程的有效执行承担监督检查责任。5.正文5.1 简述5.1.1 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将具流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。5.1.2 检测器5.1.2.1 紫外检测器（Ultraviolet detector,UV） 紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配此类检测器，是一种选择性检测器。5.1.2.2 优点：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱。5.1.2.3 缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。5.1.2.4 适用范围：大多数有紫外吸收的化合物。5.2 高效液相色谱仪的使用要求5.2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90） ”的规定进行定期检定，应符合规定。5.2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连接，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。5.2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。5.3 操作前的准备文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码2/75.3.1 流动相的制备 5.3.1.1 用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。凡规定 pH 值的流动相，应使用精密 pH 计进行调节。配制好的流动相应通过适宜的 0.45m 滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相备用。5.3.2 供试溶液的配制5.3.2.1 供试品用规定溶剂配制成供试品溶液。定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制 2 份。供试品溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的 0.45m 滤膜滤过。必要时，在配制供试品溶液前，样品需经预净化，以免对色谱系统产生污染或影响色谱分离。5.3.3 检查上次使用记录和仪器状态5.3.3.1 检查色谱柱是否适用于本次实验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动能否互溶，流动相的 pH 值与该色谱柱是否相适用，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。5.4 操作5.4.1 泵的操作5.4.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。5.4.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约 20ml，设置高流速（如9ml/min）或用冲洗键 PURGE 进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续流液后，将流速足部回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。5.4.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需 30 分钟。如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始比例的流动相对色谱柱进行平衡。5.4.2 进样操作5.4.2.1 六通阀式进样器5.4.2.1.1 把进样器手柄放在载样位置（LOAD） 。5.4.2.1.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，用定量环（LOOP）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的 5 倍，用微量注射器定容进样时，进样量不得多于环容积的 50%，在排除气泡后方能向进样器中注入供试品溶液。5.4.2.1.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试品溶液，除另有规定外，文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码3/7注射器不应取下。5.4.2.1.4 把手柄转至注样位置（INJECT） ，定量环内供试溶液即被流动相带入流路。5.4.2.2 自动进样器5.4.2.2.1 将供试品溶液经适宜的 0.45m 滤膜滤过，取续滤液置进样小瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针方向旋紧。为避免进样堵塞以及进样器损伤，一般应选择与自动进样器型号配套的进样小瓶。5.4.2.2.2 将进样小瓶依次放入贮样室内，记录瓶位置号（VIAL） 。如果自动进样器有控温功能，根据实验要求和样品稳定性，设置适宜的温度。5.4.2.2.3 检查自动进样器是否为默认位置，设定自动进样器参数，检查进样针冲洗系统是否正常，冲洗液是否足够，管路内是否有气泡等，检查流动相是否有足够的量能完成整个程序进样（sequence run） 。5.4.2.2.4 设定供试品溶液的自动进样的起始位置、终止位置、进样体积、稀释倍数、数据文件名等，用 START 开始进样。5.4.3 色谱数据的收集和处理5.4.3.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如系记录仪，则注样同时按一下记号键作起始记号。5.4.3.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。5.4.3.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量测定中，一般峰顶不得超过记录满量程。再进行正式分析操作。5.4.3.4 含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样 2 次，由全部注样结果（n4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）一般应不大于 1.5%。5.4.3.5 色谱系统适应性试验应符合中国药典的要求。5.5 测定结果处理5.5.1(1)内标法 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算校正因子： f RRSS CACAf/校正因子式中 AS和 AR分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高；CS为加入内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码4/7再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量：XCSRX XCAAfC/含量式中 AX和 AS分别为供试品（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高；CX为供试品（或其杂质）的浓度；CS为加入内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。5.5.2 外标法按各品种项下规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高） ，按下式计算含量：RX RXAACC含量式中各符号意义同上。%100%C AAi）百分含量（式中，为被测含量组分峰面积，为参与计算的全部峰面积（溶剂峰和其AiA他干扰峰除外）之和。采用本法时，应考虑：（1）最小组分和最大组分的检查响应是否在线性范围内；（2）在所用检测波长下个组分响应的差别。5.5.3 杂质检查法按药品标准规定的方法测定杂质的含量或限量使，如杂质对照品已经建立，则可按规定用上述外标法进行测定；如杂质对照品没有建立，无法获得，或杂质未知，则可按下法测定。当供试品溶液的溶剂干扰供试品溶液的测定时，应去等体积溶剂进样，并将溶剂的背景色谱响应，从供试品溶液的色谱响应中扣除。5.5.3.1 加校正因子的主成分自身对照法在已知杂质在规定检测波长下的响应因子与主成分不一致的情况下， ，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按内标法以主成分为内标计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码5/7文中，用于校正杂质的实测峰面积，再按照规定的方法计算杂质的含量。由于没有杂质对照品，应规定这类杂质峰的位置，如用相对于主成分的相对保留时间表示，还应进行方法耐用性考察，如采用 3 根以上不同品牌的色谱柱同法测定各杂质的相对保留时间，RSD 应小于 5.0%。5.5.3.2 不加校正因子的主成分自身对照法在杂质未知或未建立杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质的含量或限量。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限） ，使对照溶液中的主成分色谱峰高约达满量程的10%25%或其峰面积能准确积分（通常，含量低于 0.5%的杂质，峰面积的 RSD 应小于10%；含量在 0.5%2%的杂质，峰面积的 RSD 应小于 5%；含量大于 2%的杂质，峰面积的 RSD 应小于 2%） 。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的 23 倍，根据所得的供试品溶液中各杂质峰面积及其总和，按规定的方法计算杂质含量或限度。5.6 清洗和关机5.6.1 分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用甲醇-水冲洗，冲洗前先按（5.4.1.15.4.1.2）操作，再用分析流速冲洗，各种冲洗剂 2 一般冲洗 1530 分钟，特殊情况应延长冲洗时间。5.6.2 冲洗完毕后，逐步降低流速至 0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样器所附的专用冲洗接头。5.6.3 关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器使用前后状态等。5.7 注意事项5.7.1 色谱柱与进样器及其出口端与检测器之间应为无死体积连接，以免试样扩散影响分离。5.7.2 新柱或被污染柱用适当溶剂冲洗时，应将其出口端与检测器脱开，避免污染。5.7.3 使用的流动相应与仪器系统的原保存溶液能互溶，如不互溶，则先取下上次的色谱柱，照（5.4.1.1 和 5.4.1.2）的方法用异丙醇冲洗过渡，进样器和检测器的流通池也注入异丙醇进行过渡，过渡完毕后，接上相应的色谱柱，换上本次使用的流动相，文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码6/7再文件编号 SOP-QC-602 版号 B 页码7/7按（5.4.1.1）顺序操作。5.7.4 压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气泡是否已排除，各连接处有无漏液，排除故障后方能进行操作。如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞。5.7.5 发现记录基线波动，出现毛刺等现象，首先应考虑检测器流通池中是否有气泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘灯稳定，同时检查仪器的接地是否良好，必要时，换上新的氘灯，仪器稳定后方能进行操作。5.7.6 进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡，如系统适用性不符合规定，或填充剂以损坏，则应更换新的同类色谱柱进行分析，由于同类填充剂的化学键合相