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叶绿素等的测定方法叶绿素等的测定方法1 叶绿素含量测定:80的丙酮液的配制:4L 丙酮 + 1L 蒸馏水。称 0.5g 左右的叶片放在 50ml 的离心管(做三个重复) ,加入 25ml浓度为 80的丙酮液,放在黑暗处浸提大约 36 小时后取出,稀释4 倍后分别在波长 663nm、645nm、652nm 和 470nm 下测定光密度,以 80的丙酮液为空白。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P3536)也可用 95%乙醇溶液,在 665、649、470nm 处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定:(2.5g 样)0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (PBS)(pH=7.8)溶液的配制:65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到 4L。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导 ,P134) 。取低温保存的鲜样,称 2g 左右的叶片(或根)放在 50ml 的离心管,加入 20ml 浓度为 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.8) (最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活) ,研磨(用磨碎机磨) ,8000r/min 的冷冻离心机下离心 20 分钟,上清液为粗酶液。2.1 丙二醛(MDA)的测定:20三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称 200g 三氯乙酸,用蒸馏水定容到 1000ml。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124) ;0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称 5g 硫代巴比妥酸(TBA),用 20三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到 1000ml。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124) (先加少量的氢氧化钠 1mol/L 溶解) ;0.5ml 酶液(对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=7.8 的磷酸缓冲液代替酶液) (做三个重复)+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min冷却(至少 30min)比色(OD600、OD532、OD450) 。(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导 ,P124)2.2 超氧化物歧化酶(SOD)的测定:NBT(400ml)混合反应液 br /392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液(100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素) 。(另配)100ml PBS 溶液加 EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时:取 3ml 反应液+0.05ml(根)或 0.02 ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中 6-10 分钟,OD650 下测定吸光度。2.3 过氧化物酶(POD)的测定:0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000ml。0.3%H2O2 溶液的配制:吸 2.5ml 30%H2O2,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制:称 0.5g 愈创木酚,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。2ml 0.3%H2O2 溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml?(原来为 0.01)酶液(根加 0.05ml 酶液) (对照用 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液代替酶液) (做三个重复) ,记录 470nm 处 OD 降低速度。将每分钟 OD 增加 0.01 定义为 1 个活力单位。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导P121)比色时加酶液,混合后即刻计时。2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作:编号1234567标准脯氨酸的量(ml)00.10.20.40.60.81.0H2O(ml)1.00.90.80.60.40.20冰乙酸(ml)2222222显色液(ml)3333333脯氨酸含量(l)012468100.5ml 酶液(对照用 0.5ml 80乙醇代替) (做三个重复) + 1ml冰乙酸 + 1.5ml 显色液混匀,沸水浴 15min,冷却后测OD520。2.5 可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安,董新纯编的植物生理学实验指导 )牛血清白蛋白:配成 100g/ml 和 1000g/ml。90乙醇:90ml 乙醇 + 10ml 蒸馏水。?85(W/V)磷酸:170ml 磷酸 + 30ml 蒸馏水。考马斯亮蓝 G-250:称 0.2g 考马斯亮蓝 G-250 溶于 100ml 90乙醇中,加入 85(W/V)磷酸 200ml,用蒸馏水定容到 2L。常温下可保存一个月。标准曲线的制作:配制 0100g/ml 血清白蛋白血液管号123456100g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(ml)00.020.040.060.080.10配制 01000g/ml 血清白蛋白血液管号789101112100g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量(ml)00.20.40.60.81.00.1ml 酶液(做三个重复) + 5ml 考马斯亮蓝 G-250混匀,放置 2min 后在 595nm 下比色。2.6 过氧化氢酶(CAT)的测定:0.3%H2O2 溶液的配制:吸 5ml 30%H2O2,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 500ml。1 ml 0.3%H2O2 溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定 240nm 处OD 降低速度。将每分钟 OD 减少 0.01 定义为 1 个活力单位。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导P121)2.7 抗坏血酸(ASA)的测定:(参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P125)5 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g 三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml。10 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g 三氯乙酸,用蒸馏水定容到 250ml。150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液的配制:100ml。44 H3PO4 溶液的配制:250ml。4 2,2-二联吡啶溶液的配制:250ml。3 FeCl3 溶液的配制:100ml。首先标制作准曲线。粗酶液的提取:取低温保存的鲜样,称 0.5g 左右的叶片(或根)放在 50ml 的离心管,加入 15m 5三氯乙酸(TCA)溶液(最好是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液,防止研磨时温度过高使酶失活) ,研磨(用磨碎机磨) ,15000r/min 的冷冻离心机下离心 10 分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸(ASA)含量的测定。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126)测定:0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液 + 0.2ml H2O,混匀(振荡) ,至少 30 秒后,再依次分别加入:0.4 ml 10三氯乙酸(TCA)溶液 + 0.4 ml 44 H3PO4 溶液 + 0.4 ml 4 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3 FeCl3 溶液,混合后在37水浴中保温 60min,测定 OD525 处的值。 (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126)2.8 谷胱甘肽的测定:4g 新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L 醋酸汞 + 2ml 30醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下冲洗 2 次。向沉淀中加入 10ml 1mol/L 盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌 5min 后加入 1ml 20的碘化钾溶液,混匀,离心。上清液转入供滴定用的 100ml 玻璃管中,沉淀在搅动情况下以 10ml 水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入 0.5ml 淀粉液,用 1mmol/L KIO3 滴定,直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的 KIO3 相当于 0.307mg 谷胱甘肽。 (参考现代植物生理学实验指南 ,中国科学院上海植物生理研究所编) 。2.9 天冬酰胺合成酶(AS)的测定:2.10 天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定:3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:(1g 样) (参考陈建勋,王晓峰主编的植物生理学实验指导,P2729)亚硝酸钠标准溶液(1g/ml):称 NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸 5ml 定容到 1000ml。0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液:30.0905g Na2HPO412H2O + 2.4965g NaH2PO42H2O,加蒸馏水定容到 1000ml。3mol/L HCl:125ml 浓盐酸加蒸馏水定容到 500ml。1 磺胺溶液:5.0g 磺胺溶于 500ml 3mol/L HCl 中。0.2 a-萘胺溶液:1.0g a-萘胺溶于 125ml 冰醋酸后用蒸馏水定容到 500ml,贮于棕色瓶中。0.1mol/L KNO3 溶液:5.055g KNO3 溶于 500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。0.025mol/L pH8.7 的磷酸缓冲溶液:Na2HPO412H2O 8.8640g + NaH2PO42H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到 1L。提取缓冲液:1.211g 半胱氨酸 + 0.372g EDTA,溶于 1L 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲溶液。2mg/ml NADH 溶液:0.5g NADH 溶于 250ml 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液(临用前配制) 。首先标制作准曲线 br /取 7 支洁净烘干的 15ml 刻度试管加试剂,即配成 02.0g 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在 30保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在 540nm 波长下比色。以亚硝态氮(g)为横坐标(x) ,光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。各试剂加入顺序管 号1234567亚硝酸钠标准液(ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.20.80.401 磺胺溶液(ml)44444440.2%-萘胺(ml)4444444每管含 NO2- (g)00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml 提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于 4、4000r/min 下离心 15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶(NR)的测定。0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3 溶液 + 0.4mlNADH 溶液后混匀(对照不加 NADH 溶液,而以 0.4ml 0.1mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液代替) ,在 25水浴中保温 30min。保温结束后立即加入 1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加 1ml 0.2 a-萘胺溶液,显色反应 15min 后于4000r/min 下离心 5min,取上清液在 540nm 下比色测定吸光度。根据回归方程计算。
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