细胞培养常用试剂细胞培养常用试剂细胞培养常用试剂 点击： 2021 作者： 来源： 时间： 2007-11-10 本站论坛 器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它 BSS，如：Hanks，D-Hanks 液的配制)： 主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。用 HCl 或 NaOH 调 PH 到 7.4。移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0、温度为 37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于 4内过夜。 用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 4. 0.05胰蛋白酶0.02%EDTA 溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入 PBSA 100ml，0.22um 微孔滤膜过滤除菌，分装，于20保存。5. 青、链霉素溶液： 所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位/瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 分装于20保存。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位/ml。6. RPMI1640： 溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调 PH 到7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀。 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4冰箱内待用。 使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（4时两周有效） 。 7. 血清的灭活： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56水浴中灭活 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 8. HEPES 溶液： HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ） 。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓度为 10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下： 准确称取 HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后 4保存。 注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入2ml 即可。 9. 谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置 1 周可分解 50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为 14mmol/L。可以配制200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向 100ml培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 10. 肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为? 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml（精确可加入 0.9ml）即可。 11. 型胶原酶： 0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶-20保存。 12. 明胶溶液： 因为明胶难于过滤，所以配制 0.1明胶溶液必须用无菌的 PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克（配成 100ml 溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入 50ml 小瓶中，4保存。 13. Hanks 液：称取 KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g，加 H2O 至 1000ml 注：Hanks 液可以高压灭菌。分装于 4下保存。14. D-hanks 液：1 液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配 500 毫升；2 液：NaHCO3：0.35g/L，配 100 毫升；3 液：酚红：0.02g，用数滴 NaHCO3 溶解酚红将 2，3 液移入 1 液中。定容到 1000 毫升 PH 值是 7.4 左右。分装于 4下保存。15. Giemsa 染液： 称 Giemsa 粉末 0.5 克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为 33ml） 。56中保温 90120 分钟。加入 33ml 甲醇，置棕色瓶中保存，此为 Giemsa 原液。 使用时按要求用 PBS 稀释。一般稀释 10 倍。