药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页微生物限度检查方法验证文件微生物限度检查方法验证文件产 品 名 称杞菊地黄丸（浓缩丸）产 品 代 号C-006编 码WSW061200100药业有限公司药业有限公司药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页1 1 验证方案的制定、审核、批准验证方案的制定、审核、批准剂 型产 品 名 称丸 剂逍遥丸（浓缩丸）验 证 小 组成员职务姓 名 主 要 职 责组 长验证负责人副 组 长方案及报告审核负责人方案制度实施负责人 成 员 实 施 人起 草 人起草日期：审 核 人审核日期：批 准 人批准日期：验证方案组织实施进度年 月 日至 年 月 日2 2 目的目的建立药品微生物检查法，确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。3 3 微生物限度室的环境微生物限度室的环境本验证用无菌室光线良好、温湿度适中、远离厕所及污染区。面积 8 平方米，高度 2.2 米。由一更衣间、二更衣间、缓冲间、无菌室、阳性对照室组成。无菌室、阳性对照室分别装有传递窗。一更衣间内有洗手盆、防静电抹台面抹布、防静电抹地面抹布、0.15%新洁尔灭、吉祥牌干手器、多用途胶粘型除尘器、洁净工作鞋。二更衣间有不锈钢挂钩，挂有防静电洁净工作服、口罩。室内六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处呈凹弧形，无缝隙、无死角。室内没有下水道。墙壁、天花板采用耐腐蚀彩钢板材料，地面采用耐磨地板胶建成。操作间有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度 100 级。微生物限度室、阳性对照室分别放置 100 级超净工作台和温湿度表，装有柜式空调，药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页室内温度控制 1826，相对湿度 4565%。缓冲间及操作间内有空气消毒效果的紫外灯及臭氧消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间装有静压差计。无菌室内的照明灯嵌装在天花板内，室内光照分布均匀，光照度不低于300lx。更衣间、缓冲间、操作间和传递窗所设置的紫外线杀菌灯（22.5/m3） ，一个月定期检查辐射强度，要求在操作面上达 40Wcm2。无菌室一个月用丙二醇或甲醛交替熏蒸。每周和每次操作前用 0.15%洁尔灭消毒擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌 30 分钟。在每次操作完毕，同样用上述消毒液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置 30 分钟，将备妥的营养琼脂平板 3 个（经 3035预培养 48 小时，结果无菌落生长） ，以无菌方式（或经传递箱）传入操作间，置净化台左、中、右各 1 个，开盖，暴露 30 分钟后将盖盖上。在 3035培养箱内倒置培养 48 小时，取出检查。3 个平板生长的平均菌落数不超过 1 个。无菌操作台面或超净工作台一个请有关部门检测其悬浮粒子，应达到 100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径0.5m 的粒数不得超过 3.5 个/升，5m 的粒数为 0，空气流速应0.35m/s，可根据无菌状况必要时置换过滤器。均已验证合格。药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页4 4 主要设备仪器及器皿一览表主要设备仪器及器皿一览表名 称规 格数 量隔水培养箱GH1 台生化培养箱PYX-190S-A1 台数显恒温水浴锅HH21 台立式压力蒸汽灭菌器YXQLS50SI1 台电热恒温干燥箱WMK021 台冰箱BGD1801 台超净工作台SWCJ2FD2 台尘埃粒子计数器CLJ10D 1 台电子天平LP1502（1500g/10mg）1 台马头牌架盘药物天平JYT51 台吉祥自动干手器JXG1301 台接种环1 支电炉1 个不锈钢锅1 个酒精灯2 盏75%酒精棉球2 瓶脱脂棉1 袋灭菌剪刀1 把牛皮纸灭菌镊子2 把灭菌称样纸1 把不锈钢药匙1 把试管架2 个打火机2 个记号笔2 支锥形瓶100ml、500ml5 个、12 个培养皿90mm140 对研钵3 个量筒500ml、100ml各 1 个试管15ml、25ml4 支、17 支吸管1ml、2ml 分度 0.0125 根吸管10ml 分度 0.115 根实验记录纸1 本药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页5 5 内容内容5.1 试液及其配制0.15%新洁尔灭：用 500ml 量筒倒入 0.75ml 新洁尔灭溶液，加水至 500ml即得。75%乙醇溶液：用 100ml 量筒倒入 75ml 无水乙醇，加水至 100ml 即得。3.2 稀释剂和试剂0.9%无菌氯化钠溶液 200ml（分装 10ml8 试管、5ml12 试管）：取氯化钠1.8g，加水溶解使成 200ml，过滤，分装、灭菌。Ph7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 500ml（分装锥形瓶 100ml4 瓶）：取磷酸二氢钾 1.78g、磷酸氢二钠 3.62g、氯化钠 2.15g、蛋白胨 0.5g，加水 500ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。稀释剂配制后，分装，置立式压力蒸汽灭菌器内灭菌。灭菌温度 121，时间 15 分钟。5.2 培养基及其配制胆盐乳糖培养基 800ml、0.1%蛋白胨水 400ml、营养琼脂培养基 2000ml、改良马丁培养基 1500ml、虎红培养基 500ml、5%乳糖发酵培养基（5ml9 只试管，阳性对照、阴性对照、供试品） 。根据各培养基瓶签上的配制方法，计算、配制、分装、灭菌。5.3 菌种及菌液制备5.3.1 菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代） ，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性（从孝感市药品检验所购买的第二代菌种） 。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B)44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63 501白色念株菌（Candida albicans）CMCC(F)98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)98 003药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页5.3.2 菌种制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各接种在 10ml 营养琼脂试管中，培养 1824 小时，培养温度 3035。白色念珠菌、黑曲霉各接种在 10ml 改良马丁琼脂培养基试管中，培养2448 小时，培养温度 23。以上五种菌在斜面上生长的情况不是很好，必须先抚壮。5.4 菌种试培养皿通过这一步，确定每一管各验证菌含菌是否为 50100cfu。5.4.1 培养皿的制备将配制灭菌好的营养琼脂培养基冷却至 4345，每个培养皿倒入1520ml，共倒 42 个培养皿。将配制灭菌好的改良马丁培养基冷却至 4345，每个培养皿倒入1520ml，共倒 28 个培养皿。5.4.2 取抚壮后的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉验证菌各 1ml 于装有 9ml 的 0.9%无菌氯化钠稀释剂中，依次用 10倍递增法进行稀释，于试管中各取 0.1ml 划线培养。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各验证菌每个稀释级各划线二个营养琼脂制备的培养皿，培养温度 37，培养时间 1824 小时。白色念珠菌、黑曲霉各验证菌每个稀释级各划线二个改良马丁琼脂制备的培养皿，培养温度 23.7，培养时间 2448 小时。活活 菌菌 计计 数数 结结 果（果（cfu/mlcfu/ml）验 证 菌10-410-510-610-7大肠埃希菌85113224393105金黄色葡萄球菌23674935421021169790枯草芽孢杆菌88611098101108白色念珠菌42139591998892黑 曲 霉28489757780以上验证菌 10-6、10-7符合 50100cfu 菌，选其中一个稀释级即可（10-7） 。药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页5.5 试验准备5.5.1 将二个批号的供试品及所有已灭菌的供试品、平皿、锥形瓶、试管、吸管、稀释剂等经传递至无菌室内。每次试验所用物品必须事行做好计划，准备足够用量，避免操作中出处无菌间。编号后将全部外包装(牛皮纸)去掉。5.5.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置 30 分钟。5.5.3 关闭紫外杀灯后，操作人员用肥洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用 0.15 新洁尔灭洗手，穿防静电无菌衣、口罩、手套。5.5.4 点燃酒精灯。操作前用乙醇棉球擦手、操作台台面及扭力天平的托盘，再用乙醇棉球擦拭供试品袋的开口处周围，待干后用灭菌的手术剪将袋口的封口处剪开。5.5.5 将一个空白培养皿置操作台上、一个空白培养皿置无菌室角落里，各开盖 20 分钟，盖上盖，操作台上的一个培养皿倒入营养琼脂，作为台内空白对照；无菌室角落里倒入虎红琼脂，作为室内空白对照。5.6 供试液的制备将天平调节平衡，分别将灭菌称样纸放置在天平的左右托盘内，调节 10g游砝，用不锈钢药匙将供试品舀到天平的左托盘，称至 10g。将称好的供试品倒入灭菌研钵中，倒入 100mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液浸泡 10 分钟，上面用灭菌纸盖好。再将浸泡好的供试液研碎，移入刚倒出 100mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液锥形中。摇匀，静置。5.7 验证方法验证试验分三组进行，每组平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。（1）试验组：1ml 供试液+0.1ml 菌液（含菌 50100cfu 菌） 平皿法计数时，取最低稀释级供试液 1ml 和 50100cfu 菌试验菌，分别注入平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。（2）菌液组：0.1ml 菌液（含菌 50100cfu 菌）取 0.1ml 菌液注入平皿中，平行制备 2 个平皿，测定所加的试验菌数。（3）稀释剂对照组：1mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液+0.1ml 菌液（含药业有限公司 WSW061200100 第 1 页 共 12 页菌 50100cfu 菌）取 1mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和 0.1ml 菌液注入平皿中，平行制备 2 个平皿。（4）供试品对照组：取制备好的供试液 1ml供试液的释释（10 倍递增稀释法）从制备好的供试液取 1ml 至装有 9mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，反复吸吹 10 次，摇匀。此试管为 10-1。用 10ml 吸管在 10-1试管中吸取8ml 注入 8 个培养皿内，3 组细菌平行样，一组霉菌平行样。再从 10-1试管中取 1ml 至装有 9mlpH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中，反复吸吹 10 次，摇匀。此试管为 10-2。用 10ml 吸管在 10-2试管中吸取8ml 注入 8 个培养皿内，3 组细菌平行样，一组霉菌平行样。再从 10-2