实验五实验五 细胞骨架观察细胞骨架观察2011.04.20一、实验目的一、实验目的 了解用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细 胞骨架的网状结构。 二、实验原理二、实验原理 细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成 成分和形态结构的不同可分为微管（MT，2025nm） 、微丝（MF，57nm） 和中间纤维（IF，811nm） 。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分 裂、分化和物质运输等起重要作用。 光学显微镜下细胞骨架的观察多用 1% Triton X100（聚乙二醇辛基苯基 醚，是一种非离子型表面活性剂或称去污剂）处理细胞，可使细胞膜和细胞质 中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提掉，而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保 存，经戊二醛固定，考马斯亮兰 R250（Coomassie brilliant blue R250 是一种蛋 白质染料）染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨 架结构。微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组 成的微丝束（40nm）为网状结构。M 缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定， 在 M 缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂 EGTA 和 EDTA 螯合 Ca 离子，溶液并提 供 Mg 离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器、用具： 光学显微镜，镊子，剪刀，试管，载玻片，盖玻片， 培养皿，烧杯。 （二）材料：新鲜洋葱鳞茎。 （三）试剂： 12考马斯亮蓝 R250 染色液：0.2g 考马斯亮蓝 R250 粉加入甲醇 46.5mL、冰醋酸 7mL、蒸馏水 46.5mL。 2磷酸缓冲液(pH 6.8)：0.2149g Na2HPO412H2O、0.0816g KH2PO4 加入 100ml 蒸馏水。 3M 缓冲液(pH7.2)50mmolL 咪唑，50mmol/L)氯化钾、0.5mmolL 氯 化镁、1mmol/L 乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、0.1mmol/L 乙二胺四乙酸； 1mmolL 巯基乙醇，调至 pH 7.2。 41%Trion X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：0.5ml 100TritonX-100 加入 M 缓冲液 49.5ml。 53%戊二醛：6mL25戊二醛加入磷酸缓冲液 44mL。 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 1用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片 约 1cm2 大小若干片)，置于 50mL 烧杯中，加 入 pH6.8 磷酸缓冲液，使其下沉； 2吸去磷酸缓冲液，用 1Triton X100 处理 20min。 3吸去 Triton X100，用 M 缓冲液洗 3 次，每次 5min。 4用 3戊二醛固定 30min。 5磷酸缓冲液(pH 6.8)洗 3 次，每次 5min。 60.2%考马斯亮蓝 R250 染色 10min。 7蒸馏水洗 2 次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。 8如果染色效果好，则可依次用 50乙醇、70%乙醇，95乙醇、正丁醇、 二甲苯处理样品，各 5min，然后将样品平展于载玻片上，加 一滴中性树胶， 盖上盖玻片封片，制成永久切片。 五、结果五、结果 光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图） ，细胞壁及其分界明 显。1010 倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状 结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝 色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布； 相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。 1040 倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维 间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形 成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤 维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的 变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。