D e v e l o p m e n to far a p i dm e t h o df o rm i c r o c y s t i na n a l y s i sa n dC o n s t r u c t i o no f M i c r o c y s t i sa e r u g i n o s aP C C7 8 0 6m u t a n t sb e a r i n gd e f i c i e n c yi nt h eb i o s y n t h e s i so fm y c o s p o r i n e l i k ea m i n oa c i d sD i s s e r t a t i o nB yH UC h e n L i nD i r e c t e db yP r o f D r So n gL i R o n gI n s t i t u t eo fH y d r o b i o l o g y ，C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e sW u h a n ，H u b e i ，P R C h i n aN o v e m b e r2 0 1l目录目录目录I 摘要：。I 缩略词语表 第一章绪论l 1 1 引言l 1 2 微囊藻毒素和节球藻毒索2 1 2 1 微囊藻毒素的基本理化性质，2 1 2 2 微囊藻毒素的毒性3 1 3 微囊藻毒素的检测方法，4 1 3 1 微囊藻毒素毒性的活体检测方法4 1 3 2 微囊藻毒素的物理化学分析方法4 1 3 3 生物化学分析方法6 1 3 4 传感器和试纸条分析法9 1 4 微囊藻毒素的生物降解。1 0 1 4 1 微囊藻毒素降解微生物的分离，1 0 1 ，4 2 微囊藻毒素的生物降解机制1 3 1 4 ，3 降解微囊藻毒素细菌检测方法1 4 1 5 微囊藻毒素的生物合成1 4 1 5 1 微囊藻毒素合成酶及相关合成机制1 4 1 5 2 基于P C R 技术检测产毒与非产毒藻株1 8 1 5 3 微囊藻毒素在蓝藻细胞中的生物学功能2 0 1 6 类菌孢素氨基酸的生物合成2 0 1 6 1 类菌孢素氨基酸( M A A s ) 2 1 1 6 2 类菌孢素氨基酸( M A A s ) 在自然界中的分布2 2 1 6 3 类菌孢素氨基酸的分析方法2 4 1 ，6 4 类菌孢索氨基酸的生物合成机制，2 4 1 6 _ 5 类菌孢素在藻类中的生物学功能2 5 1 7 本论文的总体设计和目的2 7 第二章基于胶体金化学发光免疫法分析微囊藻毒素2 8 2 1 引言2 8 2 2 材料和方法2 9 2 2 1 试剂和仪器2 9 2 2 2 实验方法。3 0 2 2 2 1 样品处理3 0 2 3 结果和讨论，3 2 2 3 1 纳米金颗粒的制备和表征3 2 2 3 2 化学发光条件优化，3 4 2 3 3 免疫化学发光方法和间接竞争E L I S A 方法标准曲线的绘制3 5 2 3 4 本实验方法准确性的评估3 5 2 3 5 野外环境样品微囊藻毒素分析3 8 2 4 小结3 8 第三章表面等离子体共振传感器分析微囊藻毒素4 0 3 1 引言4 0 3 2 材料和方法4 2 3 2 1 主要实验材料和仪器4 2 3 2 2 ( M C L R ) 一B S A 的合成以及分子量测定，4 23 2 3S P R 传感器芯片的活化4 33 2 4S P R 传感器的免疫分析4 3458驯0燃Y微囊藻毒素快速分析方法建立和铜绿微囊藻P C C7 8 0 6 类菌孢素氨基酸生物合成缺陷突变体的构建32 5 间接竞争酶联免疫吸附试验( i c E L I S A ) 4 3 3 2 6 标准曲线的绘制。4 4 3 3 结果和讨论，4 5 3 3 1 ( M C L R ) B S A 结合物中M C L R 与B S A 的摩尔比4 53 32C M 5 芯片上的M C L R B S A 抗原固定4 53 3 3S P R 免疫传感器免疫反应和再生4 63 3 4S P R 免疫传感器再生，4 73 3 5S P R 传感器应用于环境样品的监测4 8 3 4 小结。，。，。5 0 第四章野外环境中降解微囊藻毒素的分离和表征5 1 4 1 引言5 l 4 2 材料和方法，5 2 4 2 1 野外环境样品采集5 2 4 2 2 野外样品的总D N A 抽提，5 34 2 3 聚合酶链式反应( p o t y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R ) ，5 3 4 2 4 微囊藻毒索降解菌的分离和纯化，5 44 2 5H P L C 检测微囊藻毒素5 5 4 2 6 微囊藻毒素降解表征5 5 4 3 结果和讨论，5 5 4 3 1 太湖和巢湖微囊藻毒素降解微生物分布5 5 4 。3 2 徽曩藻毒索降解菌的分离与纯化。5 64 3 3S p h i n g o p y x i ss p N 5 降解微囊藻毒素的能力分析6 0 4 4 小结，6 l 第五章类菌孢素氨基酸在微囊藻属中的分布及其生物合成酶基因缺陷突变体的构建6 2 5 1 引言，6 2 5 2 实验材料和方法6 3 5 _ 2 1 实验材料6 35 2 2 实验方法 5 3 结果和讨论7 0 5 3 I 铜绿微囊藻P C C 7 8 0 6 类菌素胞素氨基撇A S 生物合成酶基因7 05 3 2M A A s 生物合成基因在微囊藻属中分布7 1 5 3 3 微囊藻产类菌孢素氨基酸化学型分析，7 3 5 3 4 突变体构建7 5 5 3 5 突变体类菌孢素氨基酸合成分析7 6 5 4 小结7 8 本论文的主要创新点8 l 参考文献8 2 在学期问发表文章1 0 7 致谢1 0 8摘要摘要近几十年来，由于水体富营养化程度加剧和全球气候变暖等原因，蓝藻水华尤其是微囊藻水华在世界各地都有频繁暴发，其暴发规模也呈逐年增大的趋势。蓝藻水华能够直接影响水体中其他植物的生长甚至导致其死亡，降低水体生物多样性，破坏生态系统，给水体养殖经济带来危害。更加严重的是有的微囊藻能产生一种具有肝毒性和促进肿瘤发生的毒素( 微囊藻毒素) ，因此受到全世界的广泛关注。本论文开展了微囊藻毒素新分析方法的研究；并且利用分子生物学的手段调查了我国太湖和巢湖中微囊藻毒素降解微生物的分布，并分离纯化了一株能降解微囊藻毒素的细菌菌株。利用同源重组的方法构建了微囊藻类菌孢素氨基酸生物合成缺陷突变体。由于类菌孢素氨基酸与细胞的抗紫外线能力相关，因此本实验为研究类菌孢素氨基酸与微囊藻的抗紫外线机制之间的关系奠定基础。主要研究结果如下：1 建立了一种基于纳米金粒子的微囊藻毒素免疫化学发光检测方法。该方法主要包括间接竞争免疫反应，纳米金粒子氧化溶解和通过金离子催化l u m i n o l化学发光体系对微囊藻毒素进行定量等三个主要步骤。本方法的工作范围为0 0 5 - 1 0p g ，L ( r 2 = 0 9 9 1 4 ) ，灵敏度为0 0 2 4p g 几，远低于世界卫生组织对饮用水中微囊藻毒素浓度的建议值。利用该方法测定自然水样和鱼组织样中的微囊藻毒素水平，结果与E L I S A 所测值相吻合，表明该分析方法灵敏可靠，适合用于各种样品的分析。2 以间接抑制为免疫反应模式，发展了一种微囊藻毒素表面等离子共振分析方法。微囊藻毒素与牛血清蛋白偶联物【( M C L R ) B S A ) 合成并固定在传感器C M 5 芯片表面上，微囊藻毒素样品和单克隆抗体反应液流经芯片表面时，B I A c o r e3 0 0 0 生物传感器能监控随后的特异性免疫反应，随着样品中微囊藻毒素浓度的降低，生物传感器