Comment 小小1: 话说，我们就是大 概要测一下它们大致的破 H 呀这是 我们的目的呀Comment 小小2: 16 个，分别是：稀 释涂布 8 个，两次划线各 4 个Comment 小小3: 觉得量筒没有必要 灭菌的Comment 小小4: 我不是很懂怎么会 有 13 个呢？Comment 小小5: 觉得没有必要做 *10000 的太大了吧 a/如果还是 怕菌太多了那就少加一点水样不就 得了微生物综合实验设计方案微生物综合实验设计方案第八小组 （曹婉仪 蔡楚萍 贝锦涛 张韵红）1 1、取样取样取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，于华师校园内湖中取水样。为使取样具 有代表性和全面性，分别选取三个取样点，取样点 1：湖的东面，取样点 2：中 间湖边，取样点 3：湖的西面，分别编号 1.2.3，于水面以下 10cm，取水各 100mL，盖好瓶塞。 器具：三角瓶*3 个二、测水体二、测水体 pHpH 值值为了大致地确定水体微生物的生长适宜 pH（个人感觉这说法有点奇怪，好 像暗示测出来的 pH 就是适宜生长的 pH 似的，至少改为：为了了解华师湖水的 pH 吧，或者改为其他更好的说法） ，取好水样后，分别用 pH 计测量三个水样的 值，每个水样各测量三次，取平均值。 将三个水样混合均匀，得到混合水样，用 pH 计测量 pH 三次，取平均值。 器具：pH 计3、分离提纯分离提纯 2 2 种微生物种微生物1 1、材料：、材料：混合水样2 2、方法、方法操作名称具体步骤试剂和材料器具（经高压 蒸汽灭菌）配置牛肉膏蛋白胨 固体培养基 400mL1、配置牛肉膏蛋白胨固体培养基 400mL，分装于两个三角瓶 2、高压蒸汽灭菌 （灭菌材料：250ml 三角瓶*5，培 养皿*16，试管*11，1ml 移液管 *5,10mll 量筒*1） 3、倒 16 个平板 4 支试管斜面（按 原来写的也要 13 个平板，怎么会 是 10 个，而且还没有设置对照的 平板；如果要作10000，还要更 多平板。我觉得做 1520 个平板比 较好。NaCl 2g 蛋白胨 4g 牛肉膏 1.2g 400mL 水1mol/LNaOH 1mol/L HCI(pH77.6)高压蒸汽灭菌 锅 天平 玻璃棒 500ml 大烧杯 *1 个 250ml 三角瓶 *2 个 封口膜*2 张 绳子*2 条 培养皿 16 套 试管*4 个 胶塞/棉塞*4 个 报纸多张稀释涂布分离微生 物1、取 0.2ml 混合水样进行稀释， 设置四个梯度：原液、混合水样 蒸馏水恒温培养箱 1ml 移液管*5Comment 小小6: 涂布分离之后，我 们针对的对象就是细菌所以，只用 一种培养基培养时间也不用变化的Comment 小小7: 觉得可以写成列表 的形式这样看起来好像整洁一点哦 所以我把它改成了这样子10、100、1000，分别装于 4 个试管中，标明稀释度，每种稀 释度 5ml2、涂布 8 个平板 3、37恒温培养箱中倒置培养 24h空白平板*8 个个 10ml 量筒 试管*4 个酒精 灯 酒精棉球 涂布器 标签纸平板划线分离微生 物1、选取稀释涂布平板操作中分离 程度较好的两种微生物的平板菌落， 进行平板划线，各划线 2 个平板 2、37恒温培养箱中倒置培养 24h涂布分离的平 板 空白平板*4 个恒温培养箱 酒精灯 酒精棉球 接种环 标签纸平板划线分离微生 物1、两种微生物均选取划线操作效 果好的菌落，进行第二次平板划线 操作，各划线 2 个平板 2、 37恒温培养箱中倒置培养24h第一次划线分 离的不同菌种 的平板*2 个 空白平板*4 个恒温培养箱 酒精灯 酒精棉球 接种环 标签纸平板菌种接种到试 管保藏1、用接种环把菌种接种到试管斜 面，每个菌种接种 2 个斜面 2、37恒温培养箱中培养 24h 3、待菌种在固体斜面培养基上生 长丰满后，注明菌类或菌种名、保 藏日期、保藏人，然后置于 48 的冰箱中保存第二次划线分 离的不同菌种 的平板*2 个 空白斜面培养 基*4 个恒温培养箱 冰箱 酒精灯 酒精棉球 接种环 标签纸四、四、革兰氏染色革兰氏染色细菌的革兰氏染色 1.实验材料 1.1 材料第二次划线分离的不同菌种的平板*2 个 1.2 试剂：无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红 1.3 器具载玻片、接种环、酒精灯 2.实验方法 步骤序号操作名称操作方法 1制片涂片：滴 1 滴无菌水于载玻片，挑 取少许菌体与水滴均匀混合 干燥：火焰上方略加温 固定：用加热法，通过火焰 3 次Comment 小小8: 觉得写成“工具” 好一点吧Comment 小小9: 还是觉得列表的形 式好点的Comment 小小10: 用“培养皿”正规 点吧Comment 小小11: 感觉用“检验”不 是很好Comment 小小12: 同样的把它也调 整成列表格的形式2染色结晶紫初染 1min，水洗；碘液媒染 1min，水洗；95%乙醇脱色 2030s，水 洗；番红复染 1min，水洗 3镜检显微镜油镜观察五、观察细菌的形态特征五、观察细菌的形态特征在高倍镜和油镜下观察细菌形态，拍下照片，画图，描述形态特征器具：显微镜六、生理生化试验（淀粉水解、糖酵解）六、生理生化试验（淀粉水解、糖酵解）（1）淀粉水解实验(2)糖酵解实验 1 实验材料1.1 实验材料第二次划线分离的不同菌种的平板*2 个、空白平白*1 个、试管*5 个1.2 实验试剂 卢卡氏碘液, 葡萄糖发酵培养基试剂蛋白胨 0.1g,NaCl 0.25g, K2HPO4 0.01g,水 50ml,溴麝香草酚蓝（1%水溶液） 0.15ml，葡萄糖 0.5g1.3 实验器具恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸 2 实验方法操作名称实验方法 接种以无菌操作技术，把两个菌种接种到同一个平板上，划成“+” 字形，平板的一边接一个种 培养在平皿底部做好记号，盖上盖，37恒温培养箱中倒置培养 24h检验平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处记录结果有水解圈：淀粉水解实验阳性，用+表示；无水解圈：淀粉 水解实验阴性，用-表示操作名称操作方法 配置糖发酵培养基 配置葡萄糖发酵培养基 50ml,分装 5 支试管中，高压蒸汽灭菌 接种取葡萄糖发酵培养基试管 3 支， 分别接入两种菌种，用标签纸标明菌 类或菌名、发酵培养基名称，第 3 支 不接种，作为对照。接种后，轻摇试 管，使混合均匀 培养37恒温培养箱中静止培养 24h 观察记录结果：黄色、有气泡：产酸 产 气，用 0 表示黄色、无气泡：产酸 不产气，用+表示紫色、无气泡：不产 酸不产气，用-表示配置糖发酵培养基：分别称取蛋白胨和 NaCl 溶于热水中，调 pH 至 7.4， 再加入溴麝香草酚蓝（先用少量 95%乙醇溶解后，再加水配成 1%水溶液） ，加入 糖类，分装试管，装量 45cm 高，并倒放入一德汉氏小管（管口向下，管内充 满培养液） 。115湿热灭菌 20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷 空气排尽，以使德汉氏小管内不存在气泡。常用的糖类：如葡萄糖、蔗糖、甘 露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量常加大为 1.5%）七、配置菌悬液七、配置菌悬液八、探究八、探究 pHpH 对细菌生长的影响对细菌生长的影响1）第一次测量分光光度值 (1)材料：上述菌悬液 (2)试剂:1mol/L NaOH 或 1mol/L HCL 调至 pH 分别为 3、4、5、6、7、8、9 牛 肉膏蛋白胨液体培养基，无菌生理盐水自来水（需要热水溶解牛肉膏） 。 (3)250ml 三角瓶 7 个，试管 7 支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 7 个，pH 计， 大烧杯（是否需要校准） ，恒温摇床。 (4)步骤: 操作试剂或用具 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基NaCl 8g 蛋白胨 16g 牛肉膏 4.8g 无菌生理盐水 1600ml 7 个 250ml 三 角瓶 试管 7 支 ，每个三角瓶中倒入 200ml 液体培养基，其余分装试管（约 25ml/支）调 pH 值1mol/l NaCl 或 HCI 溶液 pH 计 包扎培养基并且灭菌高压灭菌锅 121 摄氏度 20min 接种（无菌操作）：移液管移取 20.5ml 菌悬液于不同 pH 的三角瓶中移液管 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培 养基 置于 37 度恒温箱中培养 24h恒温摇床 测分光光度值分光光度计 OD600 记录数据并且描绘关系图2）第二次测量分光光度值 (1)材料：重新配置的菌悬液 (2)试剂:1mol/L NaOH 或 1mol/L HCL 调至 pH 分别为 6、6.4、6.8、7.2、7.6、8(假设 1)中最适 pH 为 7)牛肉膏蛋白胨液体培养基， 无菌生理盐水自来水（需要热水溶解牛肉膏） 。 (3)250ml 三角瓶 5 个，试管 5 支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 5 个，pH 计， 大烧杯（是否需要校准） ，恒温摇床。 (4)步骤: 操作试剂或用具 配置牛肉膏蛋白胨液体培养基NaCl 5.5g 蛋白胨 11g 牛肉膏 3.3g 无菌生理盐水 1100ml 5 个 250ml 三 角瓶 试管 5 支 ，每个三角瓶中倒入 200ml 液体培养基，其余分装试管（约 20ml/支） 调 pH 值1mol/l NaCl 或 HCI 溶液 pH 计 包扎培养基并且灭菌高压灭菌锅 121 摄氏度 20min 接种（无菌操作）：移液管移取 20.5ml 菌悬液于不同 pH 的三角瓶中移液管 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培 养基 置于 37 度恒温箱中培养 24h恒温摇床 测分光光度值分光光度计 OD600 记录数据并且描绘关系图附： （1） 牛肉膏蛋白胨液体培养基的：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH77.6 （2） 淀粉培养基：蛋白胨 10g，NaCl 5g，牛肉膏 5g，可溶性淀粉 2g，蒸馏 水 1000ml，琼脂 1520g，121 摄氏度灭菌 20min。 （3） 糖发酵培养基：蛋白胨 0.2g，NaCl 0. 5g，K2HPO4 0.02g 水 100ml，溴 麝香草酚蓝（1%水溶液）0.3ml，糖类 1g。分别称取蛋白胨和氯化钠溶 于热水中，调 pH 至 7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量 95%乙醇溶解 后，再加水配成 1%水溶液） ，加入糖类，分装试管，装量 45cm 高，并 倒放入一德汉氏小管（关口向下，管内充满培养液） 。115 摄氏度湿热灭 菌 20min。