分子标记在植物遗传育种中的应用分子标记在植物遗传育种中的应用_ _沈法富沈法富第 28 卷第 1 期 山东农业大学学报 1997 年 3 月Vo.l 281 Journal of Shandong AgriculturalUniversity M ar. 1997文献综述分子标记在植物遗传育种中的应用 沈法富 刘风珍 于元杰(山东农业大学作物遗传育种研究所)APPLICATION OFMOLECULAR MARKERS IN PLANTGENETICS AND BREEDINGShen Fafu, Liu Fengzhen, Yu Yuanjie(Institue ofCrop Genetics and Breeding,Shandong Agri.Univ.,Taian,China,271018)Key words molecularmark; isozyme;RFLP;RAPD;DNA fingerpriting; plantbreeding【摘 要】 本文介绍了同工酶、RFLP、DNA 指纹和 PARD 4 种分子标记的发展、原理和特点,对它们在植物遗传图谱构建、基因定位、变异后代的鉴定和选择、杂交育种、回交育种、杂种优势等研究领域中的应用作一展望和概述。关键词:分子标记;同工酶;DNA 指纹;RFLP;RAPD;植物育种中图法分类号:Q943传统的植物育种是在不甚明了基因背景的条件下,通过杂交和各种育种技术,根据分离群体的形态表现和育种者的经验等对表现型累代选择,从而实现对基因型的改良。由于环境效应较易掩盖基因效应,因而育种者对目标性状的选择是耗时和费力的。在遵循和应用常规育种原则和程序下,提高植物遗传育种的效率和精确度是遗传育种发展的关键。分子标记的发展为解决这一问题开创了新的途径。分子标记是从生物的某些大分子物质(蛋白质和核酸)的多态性为基础的遗传标记,它们能够稳定遗传,且遗传方式简单,可以反映生物的个体和群体特征。目前应用广泛的分子标记有同工酶( Isozyme)、限制性酶切片段的多态性(Restriction fragment length polymorphism)、DNA 指纹(DNA fingerprinting)和随机扩增片段的多态性(Random amplified polymorphic DNA)。本文拟对它们的发现、发展、原理、特点以及在植物遗传育种中的应用作一简要概述。1 分子标记的发现、原理和特点遗传学的研究离不开遗传标记,孟德尔首次利用形态标记推导出遗传因子的分离和自由重组规律。摩尔根利用果蝇的形态标记阐述了基因的连锁和互换规律,从而为遗传学的发展奠定基础。但是,由于生物形态标记数量少,且大多数突变性状为不利性状,从而限制了形态标记的应用3 。随着生物技术的发展相继出现了多种分子标记。1.1 同工酶1952 年 Neilands 首次结晶出两种类型的乳酸脱氢酶,并证实它们为同工酶,即它们是来源相同、催收稿日期: 19951226 化反应的性质相同而分子结构有差异的酶蛋白分子,它是基因的产物,因而可作为遗传标记。同工酶作为遗传标记具有以下特点4,首先,它比较稳定,不受环境因素的影响。其次,它在种子和幼苗期就可以鉴定,且所需植物材料少,除进行酶分析外,还可以对其它性状进行观察,直至收获种子。再次,同工酶为共显性,即来自双亲的一对等位基因可以在杂交后代中同时检测出来。而不象显隐性状那样,杂交后代隐性性状被显性性状所掩盖。目前已对 30 多种植物进行了 40 多种同工酶分析,许多重要农作物都已有了比较完整的同工酶图谱。但是,在植物的群体中,仅有 1020 种同工酶表现出位点的多态性3, 4 。因而限制了同工酶的利用。1.2 RFLP 标记70 年代中期,遗传学家发现了 DNA 水平上的分子标记RFLP,它是由限制性内切酶酶解样品DNA,从而产生大量的限制性内切酶片段,通过凝胶电泳将 DNA 片段按照各自的长度分开。当酶解DNA 产生的酶切片段数量比较多时,电泳虽按片段的长度分开,但实际形成连续一片。因此,需将电泳的 DNA 通过 Southern 转移至支持膜上,利用某一片段 DNA 作为探针,使酶切片段跟探针杂交,从而显示出 RFLP。当利用同一种限制内切酶,酶解不同品种的 DNA 时,由于不同品种的 DNA 既有同源性又有变异,因而酶切片段就有差异,这种差别就是 RFLP(图 1)。它是DNA 分子水平上变异的反映,它既可以是内切酶识别序列的改变,也可能涉及部分片段的缺失、插入、易位、倒位等5 。RFLP 作为分子标记具有独特的优点6, 7 。第一,RFLP 标记等位基因之间是共显性的(图 1),因而不受杂交方式的限制,对隐性基因更有利。第二,RFLP 标记是反映基因型之间的差异,无表型效应,不受环境条件和发育阶段的影响。第三,RFLP 标记的非等位基因之间不存在上位效应以及其它形式的基因互作。因此,RFLP 标记之间无干扰。RFLP 标记也有其不足之处,大多数 RFLP 多态位点信息含量低,其多态性也过分依赖限制性内切酶的选用。图 1 RFLP 直观图及其共显性示意图Fig.1 Schematic diagram ofRLFP and its codom inace图上线段为含有 RFLP 的 DNA 区段,在基因型为 AA 的个体中,这段 DNA 含有 3 个某种限制性内切酶切点(如箭头所示)。由于酶切位点核苷酸的变化(如点突变等),中间酶切位点在等位基因型为 aa 的个体 DNA 片段上不存在,当 AA 和 aa 两种基因型的 DNA 片段被这种限制性内切酶消化并与探针杂交时,则分别显示出两种不同长度(10kb和 15kb)限制性酶切片段。而在杂合体 Aa 个体 DNA 片段中,既存在3 个酶切位点片段,又存在 2 个酶切位点片段。因此,在 RFLP 杂交图中同时存在 10kb 和 15kb 片段,即共显性。84山东农业大学学报 28 卷1.3 DNA 指纹19801984 年,人类遗传学家相继发现了人类基因组中存在着高度变异的重复序列,后称为小卫星 DNA(M inisatellite),它是以 11-60bp 为重复单位,总长度由几百个到几千个碱基组成的串联重复序列,因重复的数目不同,而表现总长度的差异,它分布整个基因组中,但主要存在近端粒处。以小卫星DNA 为探针,与众多限制性内切酶酶解核 DNA 产生的片段杂交,得到了具有个体特异性的杂交图谱,这个图谱就是 DNA 指纹,由于 DNA 指纹具有个体特异性,其遗传方式简单,因此,它是一种遗传标记。Jeffreys 推测人源小卫星 DNA 是生物进化过程中保留下来的变异较大的 DNA 序列8 。因此,可以用它来检测植物的小卫星 DNA。事实证明,利用人源的小卫星 DNA 作探针,成功地区分了黑麦、水稻9等多种植物的不同种,DNA 指纹表现了品种的特异性。1987 年,A li等10利用人工合成的寡聚核苷酸(2-4bp 为一个单位的多聚体)为探针,检测到了人的 DNA 指纹,这些寡核苷酸所检测的位点被称为微卫星 DNA(M icrosatellite)。利用寡核苷酸作为探针,也获得了多种生物的 DNA 指纹11 。DNA 指纹作为一种分子标记具有以下特点12 。第一,多位点性。对许多物种研究表明,其 DNA 指纹绝大多数是独立遗传的,因此,一个 DNA 指纹图实际能够同时检测到基因组中数十个位点的变异。第二,高度变异性。DNA 指纹表现了个体和群体的高度特异性,同一物种两个随机个体的DNA 指纹相似系数仅为 0. 22,二者指纹完全相同的概率为三千亿分之一。第三,遗传方式简单稳定。DNA 指纹遵循简单的孟德尔遗传,后代中的每一条带,都可以在双亲之一的指纹中找到,除非基因突变产生的新带。1.4 RAPD 标记1990 年 W illiam s 等13和 W elsh 等14两个研究小组同时发现一种新的分子标记RAPD 标记。它是以 DNA 聚合酶链反应技术为基础,利用人工合成的短核苷酸作为引物,以从组织中分离得到的DNA 作为模板,通过基因扩增仪合成多态性 DNA 片段。其基本原理如图 2 所示。由于不同品种 DNA 序列存在着差异,其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异,这样经 PCR 扩增后就产生了DNA 片段的多态性,这就形成了 RAPD 标记。RAPD 标记具有以下特点13, 15 。第一,RAPD 标记数量多,因为 RAPD 分析所用引物的数量是无限的,因此它可以覆盖基因组中所有位点。第二,RAPD 标记所需模板 DNA 量小,因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。第三,RAPD 所用引物没有物种限制,一套引物可以用于不同生物基因组分析。第四,RAPD 分析方便、快速,无需克隆制备、同位素标记、Southern 转移等复杂的操作。第五, RAPD 标记是显性的(图 3),因此,RAPD 标记不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。同时,RAPD 分析也保留了 PCR 反应的缺点,易产生非特异性带。为了克服 RAPD 分析的不足,在此基础上又发展了许多新技术。DAF(DNA AmplifiedFingerprinting)是以大于或等于 5 个碱基的随机核苷酸作为引物,扩增不同个体的 DNA 分子,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析,使之产生更多的多态性带16 。SCARS(Sequence Characterized Amplified Regions)是对特异的RAPD 标记进行克隆测序,并以此推测出末端 14 个核苷酸,然后合成一个 24bp 的寡核苷酸引物,它包括原来 RAPD 分析所用 10bp 和RAPD 标记末端的 14bp,然后利用此引物进行基因组扩增分子这技术不仅指出了 RAPD 标记的分子基础,而且一些由于缺失、插入引起的多态性,难以用 RAPD 分析,但可以被 SCAPS 揭示17 。除了上述所介绍的 4 种分子标记外,还有 AFLP 标记和 STS 标记,它们主要用于特殊位点标记。表1 比较了上述所介绍分子标记的技术特点和标记的遗传特点。图 4概述了各种分子标记的生物学基础以及它们和其它标记的关系。851 期 沈法富等: 分子标记在植物遗传育种中的应用图 2 PARD 循环示意图Fig.2 D iagram ofRAPD cycle当某一双链 DNA 分子在 2002000 个碱基范围内有一小段( 10 个碱基)反向对称 DNA 序列时(IR),通过单一引物(P)就可合成一段与该序列以内的 DNA 互补的新链,而这段新链又可作模板合成另一段新链。IRIRIRIRIRIRIRIRIRBBbbBb凝胶电泳图1kbBB bb Bb图 3 RAPD 标记及显性示意图Fig.3 D iagram ofRAPD marker and its dom inance图上某一物种 DNA 片段,在等位基因 B 中含有一段反向重复序列(IR),假定某一引物与其配对可扩增出 1kb 的DNA 片段。等位基因 b 由于 IR 序列的核苷酸的变化,引物不能与 DNA结合,不能扩增出 DNA 片段。当杂合体 Bb中,由于含有可扩增出 1kb 片段的序列,电泳结果可以显示出 1kb 片段,故 RAPD 标记为显性标记。86山东农业大学学报 28 卷图4 各种遗传标记的分子基础及关系Fig.4 Them ilecular basis and relationship of each geneticmarker2 分子标记在植物遗传育种研究中的应用2.1 遗传图谱的构建和基因定位表 1 4 种分子标记的比较Table 1 The comparision of 4molecularmarkers比