献给初学者：献给初学者：westernwestern blotblot 操作步骤操作步骤 20122012 版版献给初学者：western blot 操作步骤 2012 版 2011 年鄙人做western 的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份 western blot 操作步骤 2012 版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像 Endnote 那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料） ，希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的 western 条带了，所以相信你也行。为了节省时间，鄙人总结了一下 western blot Quick Guide 和一天做出western 的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette于 1981 年所著的 AnalyticalBiochemistry 中首次被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家，但印迹的对象是 DNA 链，他把这种技术称为 Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对 RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为 Northern 和 Western，与这两个技术的发明人没有关系了。一、蛋白质的样品制备：由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题: 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂） 。 样品建议分装成合适的量（比如分装出 20ul 检测蛋白质定量用） ，然后保存与-20或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。二、蛋白质定量如果要定量的话，一般选择 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求检测波长为 562nm，Bradford 为 595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马G250 混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含 50100ug 蛋白的溶液体积即为上样量（一般 8cm 宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为 150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大） 。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定） ，也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积） 。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过 15ul，加样孔的最大限度可加 20ul 样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮 35min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪95加热 5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在 4冰箱短时间保存，也可在-20冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。三、SDSPAGE 电泳1. 清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。2. 灌胶与上样 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏） 。 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多） 。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形） 。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加 1cm） 。 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由AP 以及 TEMED 决定，通常在 30min 左右，AP 不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不会超过 1h，若超过 1h 甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。由于 TEMED 催化 APS 释放相关化学基团，再由APS 释放的基团催化 Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 不新鲜的话加再多的 TEMED 效果也不佳，这就是为什么推荐 APS 每周新鲜配置的原因。 按说明书配积层胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可） ，95100加热 5min，若有沉淀可用稍低温度，比如 4555加热 1h达到变性的目的。我一般习惯分装 20ul 到 PCR 管里，先和 loading buffer 混合好，临用前用 PCR 仪加热 95C 5min，效果不错。 胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的 MV-III 型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液） 。加样前可用 5ml 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。目前我们做的 mini 胶上有10 个上样孔，一般在第一个孔加入 marker（我用的是 Fermentas 预染 marker） ，其余 9 个孔加入样品，也可在头尾孔内加入 marker，中间 8 个孔加样品。加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用 10ul 的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在分子克隆上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统 pH 的不连续性。请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90kd 以下的蛋白，转膜液都不用加 SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037%的SDS。1. 在电泳结束前 20min 开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备6 张的滤纸（长一般为 8.18.3cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min2min。目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好） 。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。也可取 10ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择，一是按照 marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸，平衡 10min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放 3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在 PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面） 、刚刚完成电泳的凝胶和另外 3 张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率） 。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做western 的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。4. 依据分子量大小电泳 1560min。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少 kD 的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用 1丽春红染液染 5min（于脱色摇床上摇） 。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入 20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合 PVDF膜） 。将膜晾干备用。使用预染 marker 话可以看见 marker 的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。五、免疫杂交反应1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1h即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜，具体原因可以参考这个帖子：http:/protein.dxy.cn/bbs/topic/178980802. 将一抗用封闭