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分类号:R 1 1 4密级:学位类别:科学学位团专业学位口 学校代码;10 0 6 2学号:2 0 1 0 6 0 2 1 4 7 学科门类:医学 又坪暑科 号硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I o N论文题目:生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式及机制研究TITLEM a n n e ra n dm e c h a n i s mo fd e a t ht o c o t r i e n o li n d u c e do nc o l o nc a n c e rc e l l s一级学科:公共卫生与预防医学二级学科:卫生毒理学论文作者:马跃指导教师:王风山研究员导师组成员:张静姝副研究员天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名:! 遨日期:M 并月刁日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。保密口,在年解密后适用本授权书。本论文属于 不保密团。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名:导师签名:山I 】1 年6 月 目知t 许月苫日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的本研究旨在通过体外培养人结肠癌S W 6 2 0 细胞、H C T - 8 细胞,利用分子生物学实验技术,通过多个角度证实生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式为p a r a p t o s i s 样死亡,并以p a r a p t o s i s 样死亡方式为中心,探讨生育三烯酚诱导结肠癌细胞发生的机制。方法1 生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式研究体外培养人结肠癌细胞,加入不同剂量的6 一生育三烯酚( 1 、2 5 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 和4 0 1 x m o l L ) 和乙醇( 溶剂对照) 作用2 4h 后,以M T T 实验观察6 一生育三烯酚对S W 6 2 0 细胞存活率的影响;按照5 、1 0 、1 5 、2 0 “m o l L6 一生育三烯酚作用于细胞,以荧光染色( A O E B 染色,D A P I 染色) 观察细胞死亡情况。按照2 0 p m o l L 弃l J 量加入6 一生育三烯酚,通过J J 口, Z , p a r a p t o s i s 抑制剂放线菌酮观察其对生育三烯酚作用的影响情况,来正面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式中存在p a r a p t o s i s 样死亡。以不同剂量的6 生育三烯酚作用于人结肠癌细胞S W 6 2 0 中,检测细胞中c a s p a s e 一3 的活性,并用抗癌阳性药物紫杉醇作为肿瘤细胞凋亡诱导剂作用于S W 6 2 0 细胞中,利用D N AL a d d e r 方法检测细胞中D N A 的降解情况,从而证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡并非典型凋亡方式。利用免疫细胞化学检测细胞中细胞自噬标记蛋白L C 3 的表达情况来观察生育三烯酚诱导人结肠癌细胞产生的这种空泡化死亡现象与细胞自噬的关系,从而排除细胞自噬的可能,从反面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式为p a r a p t o s i s 样死亡。为了排除细胞系的特异性,本实验中增加了另一种人结肠癌细胞系,H C T - 8细胞。将v 一生育三烯酚作用于H C T - 8 细胞,观察细胞死亡情况,同时检测细胞中c a s p a s e - 3 的活性,作为细胞系平行实验。2 6 生育三烯酚诱导人结肠癌细胞S W 6 2 0 死亡的机制研究体外培养S W 6 2 0 细胞,加入的2 0 L L m o l L 6 一生育三烯酚作用2 4h 后,通过免疫细胞化学矛 1 w e s t e mb l o t i n g 的方法检测细胞内质网膜蛋白标志物钙连蛋白和内质网应激标记蛋白B i p 的表达情况,检测6 生育三烯酚诱导人结肠癌细胞出现空泡化死亡的现象与内质网应激的关系;在S W 6 2 0 细胞中加入w n t 通路抑$ 蛴J J F H 5 3 5天津医科大学硕士学位论文抑制细胞中w n t 通路的激活,观察细胞的形态学变化,并利用w e s t e r nb l o t i n g 方法检N w n t 通路关键因子B c a t e n i n 的表达量变化,检测6 一生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡与W n t 通路的关系。结果1 与乙醇对照组相比,6 生育三烯酚作用于结肠癌细胞S W 6 2 02 4h 后,各剂量组均可以使S W 6 2 0 细胞存活率降低( p p 生育三烯酚 a 一生育三烯酚,其中6 生育三烯酚作用2 4 h 后,对D U l 4 5 、P C 3 及L N C a P 三种细胞系的I C 5 0 分别为2 0 、3 2 和2 6 1 a m o l L 。W e n g 等【1 9 J 研究显示,浓度为4 肛g m L 的6 生育三烯酚即可显著抑制脐静脉内皮细胞( H u V E C s ) 增殖。抑制强弱顺序为:6 生育三烯酚富含生育三烯酚的棕桐油( T R F ,t o c o t r i e n o l r i c hf r a c t i o n sf r o mp a l mo i l ) c 【生育酚。N a k a g a w a 等【2 0 】在研究生育三烯酚抑制血管发生机制中发现,6 生育三烯酚抑制作用最强。最近有研究发现,6 一生育三烯酚可致人结肠癌细胞S W 6 2 0 发生p a r a p t o s i s样死亡 2 1 1 。多年来,细胞程序性死亡( P C D ) 是c a s p a s e 依赖性细胞死亡的代名词,随着研究的深入,人们发现,c a s p a s e 依赖性细胞死亡只是纷繁复杂的细胞程序性死亡中的一种。P C D 的机制是复杂多样的,其机制中除了c a s p a s e 依赖性的经典凋亡以外,还有c a s p a s e 非依赖性途径。现在已知的c a s p a s e 非依赖性细胞死亡主要有p a r a p t o s i s 、自体吞噬( a u t o p h a g y ) 以及线粒体相关机制。近年来人们对p a r a p t o s i s 的研究与发现已越来越受到人们的关注。M iJ i nY o o n 掣2 2 J 发现并证实,姜黄素可诱导乳腺癌细胞发生p a r a p t o s i s 死亡,并对正常乳腺细胞无影响。B i n g h u iL i t 2 3 】等发现皂苷可诱导结直肠癌细胞发生a p o p t o s i s 和p a r a p t o s i s 死亡。P a r a p t o s i s 是不同于凋亡的死亡方式,表现为细胞肿胀和细胞质空泡化,而且没有细胞膜皱褶、细胞核浓缩等细胞凋亡的特征,胞浆密度增加,成大大小小空泡;线粒体肿胀,嵴断裂、消失,形成空泡;内质网肿胀,形成空泡。晚期染色质不规则聚集,呈接缝样细胞,不引起周围组织炎症。D N A 降解不规则。这一过程并不包括程序性死亡a p o p t o s i s 典型的核固缩、D N A 降解、c a s p a s e 激活等特征。近来有研究发现,A L G 一2 作用蛋I 刍A I P 1 A l i x 可以特异性抑制p a r a p t o s i s的效应,但是对凋亡却无抑制作用【2 4 , 2 5 ,并有研究发现由胰岛素样生长因子1 受体,表皮生长因子,和T A J T R O Y ( - - * O i l 中痛坏死因子受体) 来诱导p a r a p o p t o s i s样死亡【2 6 1 。并有研究证实,p a r a p t o s i s 的形成需要新蛋白质的合成,放线菌酮为一种蛋白质合成抑制剂,可有效阻断p a r a p t o s i s 的形成j 。天津医科大学硕士学位论文c a s p a s e 非依赖性细胞凋亡还有一种形式:自体吞噬( a u t o p h a g y ) ,自体吞噬的特征为细胞将自己细胞质的一部分( 如线粒体和内质网) 包围起来形成液泡( 自体吞噬泡) ,再依靠初级溶酶体供应的水解酶将其消化,可由于饥饿和激素的作用等诱导产生。有研究显示G F P L C 3 为较成熟的细胞自噬标记物,若这种空泡样的细胞死亡为细胞的自体吞噬的话,G F P L C 3 将会稳定的表达。L C 3 I I为第一个被认同的与细胞自噬特异性相关的蛋白【2 8 】。在本实验中,选用人结肠癌细胞系作为受试细胞,观察生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的死亡方式以及这种死亡方式出现的可能机制。结肠癌作为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病与死亡率仅次于胃癌、食管癌、肺癌排在第四位。现有研究表明,生育三烯酚对人结肠癌细胞有增殖抑制作用。A g a r w a l 等【2 9 】证明富含生育三烯酚的棕榈油( T R F ) 通过不依赖于细胞周期l 均p 5 3 信号途径诱导人结肠癌R K O 细胞凋亡。E i t s u k a 等【3 0 】发现高浓度生育三烯酚的维生素E 能抑制人结直肠腺癌细胞增殖,以6 生育三烯酚的抑制作用最强。9 0 以上的结肠癌中存在W n t 经典信号途径的激活【3 l 】。W n t 信号途径是一条在生物进化过程中极为保守的通路,从低等生物果蝇直至高等哺乳动物,其成员都有高度的同源性。该途径涉及胚胎发育和肿瘤形成过程中的多种分化事件。而途径中成分的异常改变( 女【I A P C 、1 3 - c a t e n i n 、A x i n 等突变) 致其不恰当的激活几乎发生在所有结直肠癌【3 2 1 。针对该信号通路的分子靶向治疗策略有望为癌症的治疗提供新的有效途径。研究目的、方法本研究旨在通过体外培养人结肠癌S W 6 2 0 细胞、H C T - 8 细胞,利用分子生物学实验技术,通过多个角度证实生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死L 方式为p a r a p t o s i s 样死亡,并以p a r a p t o s i s 样死亡方式为中心,探讨生育三烯酚诱导结肠癌细胞发生死亡的机制。本实验分为两个部分。第一部分为生育三烯酚诱导结肠癌细胞死L 的死亡方式的研究,有研究证实6 一生育三烯酚和Y 两种生育三烯酚均可诱导人结肠癌细胞S W 6 2 0 发生不依赖于c a s p a s e 的空泡样死亡。本部分主要对这种空泡样死亡的死亡方式,从多个角度进行研究。通过形态学观察空泡发生,并通过加入天津医科大学硕士学位论文p a r a p t o s i s 抑制剂放线菌酮观察其对生育三烯酚作用的影响情况。为了排除细胞系的特异性,实验中选用r 生育三烯酚作用于另一种人结肠癌H C T - 8 细胞,并观察细胞形态,检测细胞中c a s p a s e 3 的活性,作为平行对照。从正面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式中存在p a r a p t o s i s 样死亡。以不同剂量的6 生育三烯酚作用于人结肠癌细胞S W 6 2 0 中,检测细胞中c a s p a s e 3 的活性;免疫细胞化学检测细胞中细胞自噬标记蛋I 兰t L C 3 的表达情况;并以典型凋亡阳性药物紫杉醇作为肿瘤细胞凋亡诱导剂作用于S W 6 2 0 细胞中,利
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