1人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则（征求意见稿）一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。二、适用范围人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的、环2状双链 DNA 病毒，基因组长约 8000 碱基对（bp），分为 3 个功能区，即早期转录区（E 区）、晚期转录区（L 区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，能引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及粘膜生殖道上皮增生性损伤。HPV 广泛存在于自然界，据统计 70%80%的女性在其一生中会有至少一次的 HPV 感染。但大多数感染为自限性，超过90的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在 6 到 24 个月之间可以清除感染。而持续性的高危型 HPV 感染则是导致宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的主要原因。根据 HPV 各型别致病力大小或致癌危险性大小不同可将感染生殖道和肛门的 HPV 分为低危型和高危型两大类。高危型 HPV 感染被视为几乎所有宫颈癌发生的必要条件，全球范围的研究结果显示，在 99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型 HPV DNA 的存在，其中 HPV16 型、18 型、45 型和 31 型感染占 80%。低危型 HPV 一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据 WHO 国际癌症研究机构（IARC）的研究成果，本指导原则建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73 等 15 种基因型列为高危型，本指导原则中所述的检测试剂及其要求均只针对用于宫颈癌相关预期用途的（上述 15 种）高危型 HPV 核酸检测，如申报产品涉及上述 15 种型别以外的其他 HPV 基因型，则申请人需提出明确的理由和依据，且应得到国际有关权威机构的文献支持。3目前国际上通用的宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的筛查方法，可发现早期病变。但受方法学所限，宫颈细胞学检查存在一定的漏诊及误诊率。高危型HPV检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检测敏感性，并降低筛查频率。本文所述人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂是指利用包括 PCR-荧光探针法或其他分子生物学方法在内的核酸检测技术，以特定高危型 HPV 核酸（包括 DNA 和 RNA）序列为检测目的，对人宫颈样本(如人宫颈脱落上皮细胞)进行体外定性检测的试剂，以确定受试样本中是否存在高危型 HPV 病毒，或同时鉴定感染 HPV 的基因型别。这里所述的 HPV 核酸检测试剂是指可同时检测多种基因型 HPV 但不能对阳性结果进行基因分型的试剂，HPV 基因分型试剂是指检测多种基因型 HPV 的同时可以对 HPV 阳性结果进行基因分型的试剂。其中，可检测的HPV 基因型别应至少包含 16 和 18 型。此类试剂检测结果在临床上用于：1）筛查子宫颈细胞学检查为 ASC-US（意义未确定的非典型鳞状上皮细胞）结果的患者，以确定阴道镜检查的需要（以下简称 ASC-US 人群分流用途）；2）对于 30 岁及以上的女性，用于辅助子宫颈细胞学检查以筛查是否有高危型 HPV 感染，此检测联合细胞学病史的评估、其他危险因子以及专业的指导方案可被用于指导患者的管理（以下简称宫颈癌辅助筛查用途）；3）对于某年龄段（根据临床试验结果而定）女性，用于筛查是否有高危型 HPV 感染，此检测联合细胞学病史的评估、其他危险因子以及专业的指导方案可被用于指导患者的管理4（以下简称宫颈癌一线筛查用途）。在年龄30 岁的女性中，虽然 HPV 感染率很高，但其自主清除率也很高，因此若产品适用范围包括 30 岁以下宫颈细胞学检查正常的女性，则申请人应提供充足的理由，并就相关人群进行临床性能的充分验证。低危型 HPV 检测的临床价值尚不明确，若申请人提出相关产品注册，则应详细解释其临床意义和适应症，并提供充分的证据；鉴于 HPV 病毒载量与宫颈癌风险尚无明确的相关性，且此类试剂的样本采集方法不利于量值溯源，因此建议检测试剂定位为定性检测，不建议进行定量或半定量检测的试剂的注册；此外，本指导原则只针对与宫颈癌相关的 HPV 检测，因此不适用于除宫颈样本外其他样本类型的检测。本指导原则适用的检测方法主要指基于核酸检测的分子生物学技术。现有 HPV 核酸检测技术主要包括第二代杂交捕获法（HC2）、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及 PCR-杂交法等。这些方法在性能评价上可能会略有差异，但在技术指标方面均适用于本指导原则，以下有关注册申报资料的要求主要针对 PCR-荧光探针法提出，其他方法学试剂应针对产品自身特点进行相应补充或修正。由于宫颈癌筛查涉及面广，故由假阴性和假阳性 HPV 检测结果引起的潜在公共卫生损害风险较为显著。因此，确立良好的性能指标并充分理解 HPV 检测的临床意义，对于此类产品的安全有效性评价至关重要。产品性能如不符合临床需求，可能导致对患者所作的决策错误。假阴性结果可能导致宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导致不必要的频繁筛查和侵袭性处置。总体来说，此类试剂分析及临床性能的评价应有严格5的控制，同时亦应重点关注临床的合理应用和检测结果的科学解释。三、注册申报资料要求（一）综述资料此类产品的综述资料中，与预期用途相关的临床适应征背景情况的描述应着重于高危型HPV核酸检测和宫颈癌之间的相关性，及HPV检测临床应用的限定要求，陈述应科学、客观且有依据。与国内外同类产品的比较内容应着重从方法学及HPV基因型检出能力等方面进行比较。综述资料的撰写应符合体外诊断试剂注册管理办法（总局令第5号）（以下简称办法）和体外诊断试剂注册申报资料要求及说明（总局2014年第44号公告）（以下简称“44号公告”）的相关要求。（二）主要原材料研究资料此类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）及企业参考品、试剂盒对照品（质控品）等。应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、对照品（质控品）的定值试验资料等。1.引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物、探针，并针对所有预期适用的 HPV 型别进行检出能力和特异性（如交叉反应）的评价，提供筛选的研究数据。如引物、探针由外部供应商合成，则还需针对供应商的选择提供评价数据。引物、探针的质量标准应至少包括纯度检查、浓度检查及功能性实验等。2.酶：需要的酶主要包括 DNA 聚合酶，其质量标准应包括DNA 聚合酶活性、核酸内切酶活性、热启动能力、热稳定性等；6还可能涉及尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG/UNG）和逆转录酶，亦应分别对其酶活性等进行评价和验证。3. dNTP：质量标准应至少包括纯度检查及功能性实验等。4.若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交生产工艺验证报告；如主要原材料购自其他供货商，则需提供供货方出具的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。5.试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现，所有阳性对照品（质控品）的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为 DNA 或 RNA。建议对每个反应体系（管）设置至少一份阳性对照品（质控品），可不包含所有涉及的 HPV 基因型，但应选择临床较常见的基因型。对照品（质控品）可采用质粒等基因工程产品进行配置。阴性对照品（质控品）用以对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。阴性对照品（质控品）应参与样本核酸的平行提取。内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。建议采用人管家基因，而不建议采用外源添加 DNA 片段，从而监控细胞采集的数量和质量是否达到要求。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料1.介绍产品主要生产工艺，可以图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。2.反应原理介绍。3.详述样本收集液、样本处理方式的选择和设置。74.确定最佳反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP 浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。5.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。6.如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。（四）分析性能评估资料申请人应提交生产者在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、试验方法、可接受标准、试验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评价的试验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进行。对于此类产品，性能评估中采用参考品或样本的核酸性质（DNA 或 RNA）应与产品预期检测的靶物质一致；鉴于此类产品的样本采集方法不易标准化，而样本采集过程对检测结果的准确性至关重要，因此，如产品可采用不止一种样本采集方法（包括使用的采集设备和样本收集液），则应针对不同的采集方式分别完成性能评估，并在临床研究中进行同源样本的对比试验，证明不同的样本采集方式不会影响检测结果。鉴于 HPV 病毒尚不能体外培养，阳性/阴性参考品、检测限及精密度评价样品（除非特别说明）可采用感染 HPV 的细胞系，也可采用人工克隆或合成的 HPV 基因组 DNA（或转录RNA）。各项性能评价应符合以下要求。81.核酸分离/纯化性能在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸分离/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除 PCR 抑制物。无论检测试剂是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸分离/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，提供详细的验证资料。2.阳性/阴性参考品符合率无论试剂盒能否进行 HPV 基因分型，阳性参考品均应针对所有适用的 HPV 基因型分别设置，以分别验证各种 HPV 基因型均可以在适当的浓度被检测到。阴性参考品应考虑检测特异性的评价，适当纳入其他 HPV 基因型样品和其他病原体样品，应检测为阴性。3.最低检测限针对每种不同的 HPV 基因型分别配制系列稀释的样品进行最低检测限的评价，系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间（0100%），可通过概率计算或其他适当方法进行测算选取适当检出率水平的浓度作为最低检测限确定的标准，如