生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, February 25; 25(2): 215-222 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjbim.ac.cn 2009 Institute of Microbiology, CAS Accepted: November 28, 2008 Supported by: the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2006AA020203, 2007AA05Z417, 2007AA100703), Program for New Century Excellent Talents in University (No. NCET-07-0336). Corresponding author: Yunjun Yan. Tel: +86-27-87792214; Fax: +86-27-87792213; E-mail: yanyunjuntom.com 国家“863”计划项目(Nos. 2006AA020203, 2007AA05Z417, 2007AA100703), 教育部新世纪优秀人才基金(No. NCET-07-0336)资助。 工业生物技术基于 T7 表达系统的洋葱伯克霍尔德菌 G63 脂肪酶同源 高效表达 贾彬, 杨江科, 闫云君 华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室, 武汉 430074 摘 要: 为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达, 将目前被广泛使用的 T7 重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63 中进行脂肪酶同源表达。 首先采用 PCR 从大肠杆菌 BL21(DE3)中得到 T7 RNA 聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒 pJQ200SK 上, 然后在 T7 RNAP 前后各加入 500 bp 用于同源重组的片段, 再通过三亲本杂交把 T7 RNAP 整合到 B. cepacia 基因组上, 使 T7 RNAP 受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控。 接着把 lipA和它的伴侣基因 lipB 单独或全部克隆到载体 pUCPCM 和 pBBR22b 上, 构建出 pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMlipAB、pUCPCMlipA、pUCPCMlipAlipB、pUCPCMlipA、pUCPCMlipB 七种表达质粒, 通过电转化将上述表达质粒转化到含 T7 RNAP 的 B. cepacia 宿主菌中, 最终得到一系列脂肪酶基因工程菌。通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒 pUCPCMlipAB 的工程菌脂肪酶酶活最高, 达到 607 U/mg, 与野生菌相比酶活力提高 2.8 倍, 并且除含pUCPCMlipB 的工程菌外, 其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高。野生菌与工程菌 pUCPCMlipAB 的发酵液经硫酸铵沉淀, Sephadex G-75 凝胶过滤纯化后, 比酶活分别为 29 984 U/mg 和 30 875 U/mg。以上结果表明, 构建的基于T7 表达系统的 B. cepacia 脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量, 同时说明分泌信号 PelB 和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用。 关键词: T7 RNA 聚合酶表达系统, 同源表达, 三亲本杂交, 洋葱伯克霍尔德菌 G63 Homologous expression of Burkholderia cepacia G63 lipase gene based on T7 RNA polymerase expression system Bin Jia, Jiangke Yang, and Yunjun Yan Key Laboratory of Molecular Biophysics of Ministry of Education, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China Abstract: In order to realize over-expression of Burkholderia cepacia (B. cepacia) lipase, we introduced the widely used T7 RAN polymerase expression system into B. cepacia G63 to over-express the lipase gene. By using PCR technique, we amplified the T7 RNA polymerase gene (T7 RNAP) from the BL21 (DE3) and cloned it into the suicide plasmid pJQ200SK. After that, we flanked T7 RNAP with two 500 bp homologous fragments and integrated it into the genomes of B. cepacia by tri-parental mating, so that T7 RNAP was under-controlled by lipase gene (lipA) promoter. Then, we cloned the lipA and its partner gene lipB into the vector 216 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2 Journals.im.ac.cn pUCPCM and pBBR22b both or separately. Therefore, we got 7 expression plasmids pBBR22blipAB, pBBR22blipA, pUCPCMlipAB, pUCPCMlipA, pUCPCMlipAlipB, pUCPCMlipA, pUCPCMlipB, and then electroporated them into B. cepacia containing T7 RNA. After shake flask culture, we found B. cepacia containing pUCPCMlipAB produced the most quantity of lipase, and lipase activity was up to 607.2 U/mg, 2.8-folds higher than that of the wild strain. Moreover, lipase activities of all engineering strains except the one containing pUCPCMlipB were enhanced to some extent. The specific activities of wild type B. cepacia and B. cepacia containing pUCPCMlipAB were respectively 29 984 U/mg and 30 875 U/mg after ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. The T7 RNA polymerase expression system could effectively enhanced lipase expression in B. cepacia, and secretion signal PelB and ribosome-binding site may promote lipase expression in engineering strain. Keywords: T7 RNA polymerase expression system, homologous expression, tri-parental mating, Burkholderia cepacia G63 脂肪酶(EC3.1.1.3, 甘油三酰酯水解酶)是一种自然界广泛存在的/水解酶。它能催化长链甘油三酯进行酯水解、酯交换、酯合成等反应而被广泛应用于食品和油脂加工、饲料、精细化工、生物能源、生物防治等领域1, 具有重要的经济价值, 市场前景广阔。洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)又 名 洋 葱 假 单 胞 菌 (Pseudomonas cepacia), 是Burkholder 于 1949 年发现的一类革兰氏阴性菌2。B. cepacia 脂肪酶具有稳定性高、反应活性强、催化反应类型多、对映体选择能力强等优点格外引人注目3。 国外对 B. cepacia 脂肪酶的研究比较早。Jrgensen等4首先克隆了B.cepacia脂肪酶基因并指出该脂肪酶基因需要一个伴侣基因的帮助才能实现正确折叠。Petra 等5的研究发现 B. cepacia 脂肪酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达成无活性的包涵体形式。后来的研究还发现, B. cepacia 脂肪酶的分泌与折叠还与细胞内 Dsb 复合体等多种蛋白质相关6。国内, Yang JK 等7利用脂肪酶自身的启动子成功地实现了 B. cepacia 脂肪酶同源表达, 但还存在产酶过程不可控、表达不稳定等技术问题。 基于 T7 RNA 聚合酶(T7 RNAP)及其强启动子之间识别的特异性和转录的高效性而建立起来的表达系统, 为目前在大肠杆菌中表达外源基因的最强大表达系统之一。在体内 T7 RNAP 几乎能完整地转录在 T7 启动子下游的所有 DNA 序列, 转录效率极高8。因此, 在 B. cepacia 中利用 T7 RNAP 表达系统对脂肪酶基因进行高效的转录和翻译可能会很好地解决上述问题。 本实验以同源重组的方法将 T7 RNA 聚合酶基因整合到 B. cepacia 基因组中并受脂肪酶基因自身启动子的调控, 成功将 E. coli T7 表达系统移植到 B. cepacia 中, 实现了 B. cepacia 脂肪酶的高效表达和严谨调控。该系统的建立为洋葱伯克霍尔德脂肪酶工业化生产奠定了良好基础, 同时也为利用洋葱伯克霍尔德表达重组蛋白做了探索。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、培养基及其培养条件 菌株: B. cepacia G63 为本实验室从油污土壤中筛选得到。E. coli DH5和 BL21(DE3)为本实验室保存的菌种。B. cepacia 在常规培养基 LB 中30oC 培养, 根据需要分别加入相应的抗生素。无特别说明 E. coli 均在 37oC 培养。抗生素使用浓度如下: 氨苄青霉素, 100 g/mL; 甲氧苄氨嘧啶,